Повышение уровня синтеза белка YciM позволяет снизить загрязнение эндотоксинами рекомбинантных белков, получаемых в Escherichia сoli

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Загрязнение эндотоксинами рекомбинантных белков, полученных из Escherichia coli, в ряде случаев является достаточно серьёзной проблемой. Одним из путей её решения может быть использование специальных модифицированных штаммов со сниженным содержанием липополисахаридов (ЛПС). Мы сравнили два подхода к получению подобных штаммов. Первый достаточно широко известен и заключается в модификации метаболического пути синтеза ЛПС с помощью нокаута семи генов E. coli. Второй подход, ранее не применявшийся, основан на повышении экспрессии белка E. coli YciM. По литературным данным, повышение экспрессии YciM приводит к снижению количества белка LpxC, который является ключевым ферментом пути биосинтеза ЛПС. Мы решили проверить, приведёт ли коэкспрессия YciM и eGFP к снижению количества эндотоксинов в препаратах выделенного рекомбинантного eGFP. В итоге оба подхода показали сходный результат. И в том и в другом случае происходит падение количества эндотоксинов в препаратах очищенного модельного белка.

Об авторах

П. А Бобровский

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства;Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

119435 Москва, Россия;141701 Долгопрудный, Московская обл., Россия

Д. Д Харлампиева

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства

119435 Москва, Россия

С. А Кириллин

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства

119435 Москва, Россия

К. А Бровина

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства;Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

119435 Москва, Россия;141701 Долгопрудный, Московская обл., Россия

Е. Н Графская

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства

119435 Москва, Россия

В. Н Лазарев

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства;Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

119435 Москва, Россия;141701 Долгопрудный, Московская обл., Россия

В. А Манувера

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства;Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: vmanuvera@yandex.ru
119435 Москва, Россия;141701 Долгопрудный, Московская обл., Россия

Список литературы

  1. Raetz, C. R., and Whitfield, C. (2002) Lipopolysaccharide endotoxins, Annu. Rev. Biochem., 71, 635-700, doi: 10.1146/annurev.biochem.71.110601.135414.
  2. Bos, M. P., Robert, V., and Tommassen, J. (2007) Biogenesis of the gram-negative bacterial outer membrane, Annu. Rev. Microbiol., 61, 191-214, doi: 10.1146/annurev.micro.61.080706.093245.
  3. Yoon, S. H., Jeong, H., Kwon, S. K., and Kim, J. F. (2009) Genomics, Biological Features, and Biotechnological Applications of Escherichia coli B: "Is B for better?!", in Systems Biology and Biotechnology of Escherichia coli (Lee, S. Y., ed), Springer, Dordrecht, doi: 10.1007/978-1-4020-9394-4_1.
  4. Mamat, U., Wilke, K., Bramhill, D., Schromm, A. B., Lindner, B., Kohl, T. A., Corchero, J. L., Villaverde, A., Schaffer, L., Head, S. R., Souvignier, C., Meredith, T. C., and Woodard, R. W. (2015) Detoxifying Escherichia coli for endotoxin-free production of recombinant proteins, Microb. Cell Fact., 14, 1-15, doi: 10.1186/s12934-015-0241-5.
  5. Kayagaki, N., Wong, M. T., Stowe, I. B., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C., Akashi-Takamura, S., Miyake, K., Zhang, J., Lee, W. P., Muszyński, A., Forsberg, L. S., Carlson, R. W., and Dixit, V. M. (2013) Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4, Science, 130, 1246-1249, doi: 10.1126/science.1240248.
  6. Park, B. S., Song, D. H., Kim, H. M., Choi, B. S., Lee, H., and Lee, J.-Oh (2009) The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex, Nature, 458, 1191-1195, doi: 10.1038/nature07830.
  7. Mahalakshmi, S., Sunayana, M. R., Saisree, L., and Reddy, M. (2014) YciM is an essential gene required for regulation of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli, Mol. Microbiol., 91, 145-157, doi: 10.1111/mmi.12452.
  8. Jiang, Y., Chen, B., Duan, C., Sun, B., Yang, J., and Yang, S. (2015) Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system, Appl. Environ. Microbiol., 81, 2506-2514, doi: 10.1128/AEM.04023-14.
  9. Klock, H. E., and Lesley, S. A. (2009) The Polymerase Incomplete Primer Extension (PIPE) method applied to high-throughput cloning and site-directed mutagenesis, Methods Mol. Biol., 498, 91-103, doi: 10.1007/978-1-59745-196-3_6.
  10. Dower, W. J., Miller, J. F., and Ragsdale, C. W. (1988) High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation, Nucleic Acids Res., 16, 6127-6145, doi: 10.1093/nar/16.13.6127.
  11. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., and Falkow, S. (1996) FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP), Gene, 173, 33-38, doi: 10.1016/0378-1119(95)00685-0.
  12. Mamat, U., Woodard, R. W., Wilke, K., Souvignier, C., Mead, D., Steinmetz, E., Terry, K., Kovacich, Ch., Zegers, A., and Knox, C. (2013) Endotoxin-free protein production - ClearColiTM technology, Nat. Methods, 10, 916, doi: 10.1038/nmeth.f.367.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Российская академия наук, 2023