Microbial films Staphylococcus epidermidis ATCC 29887 on the surface of zirconium dioxide. Experimental study

Full Text

Введение Материалы, используемые в ортопедической стоматологии для изготовления имплантатов, должны обладать не только комплексом физико-механических характеристик, но и параметрами биоинертности к тканям пациента и его сапрофитной микрофлоре. Так, ротовая полость является местом жизнедеятельности разнообразных микроорганизмов [1], в том числе патогенных, способных формировать на поверхностях конструкционных материалов особые многослойные биологические структуры, представляющие собой специфические сообщества микроорганизмов - бактериальные пленки [2]. Такие пленочные структуры не только изолируют вводимый чужеродный материал от тканей организма, но и могут вызывать патологические процессы [3, 4], которые приводят к развитию осложнений и хронизации воспалительных заболеваний при установке имплантационных систем и зубных протезов. Активными образователями биопленок являются коагулазонегативные стафилококки вида Staphylococcus epidermidis, представители которого известны как наиболее частые возбудители нозокомиального сепсиса и инфекций, ассоциированных с полимерными и металлическими имплантируемыми устройствами [5]. На современном этапе развития ортопедической стоматологии в качестве материала для изготовления имплантационных систем и зубных протезов широко используется диоксид циркония. Однако в литературе до сих пор отсутствуют данные (помимо результатов физико-механических испытаний) о влиянии различных стабилизирующих добавок в композитах циркония на эксплуатационные характеристики изделий из этого материала и атакуемости их поверхностей сапрофитной бактериальной микрофлорой. Цель работы - изучение образования и роста пленок Staphylococcus epidermidis ATCC 29887 на поверхности диоксида циркония, стабилизированного оксидами иттрия и церия. Материал и методы Образцы керамики для исследований получали на кафедре «Материалы, технологии и конструирование машин» Пермского национального исследовательского политехнического университета. Использовали нанопорошки диоксида циркония, стабилизированного 3 мол.% оксида иттрия (далее ZrO2-3Y2O3), производства фирмы «TOSOH” (Япония) и диоксида циркония, стабилизированного 15 мол.% диоксида церия (далее ZrO2-15CeO2), полученного в лабораторных условиях по золь-гель технологии с введением полимерных добавок [6]. Порошки компактировали методом полусухого прессования при давлении 200 МПа и спекали при изотермической выдержке при 1350oC. Получены образцы d = 7 мм и h = 1 мм. Фазовый состав образцов исследовали методом спектроскопии комбинационного рассеяния света (КР-спект- роскопии). КР-спектры получали на многофункциональном спектрометре комбинационного рассеяния света SENTERRA “Bruker” при длине волны излучающего лазера 532 нм и интенсивности излучения 5 mV. Микроструктуру материалов изучали методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на аналитическом автоэмиссионном растровом электронном микроскопе ULTRA 55 (‘^arl Zeiss”, Германия). Шероховатость образцов изучали на атомно-силовом микроскопе Dimension Icon (“VEECO”, США) в полуконтактном режиме работы прибора. Радиус острия зонда - 10 нм. Для исследований роста пленок S. epidermidis образцы диоксида циркония автоклавировали в индивидуальных стеклянных завинчивающихся флаконах при 121 oC в течение 60 мин. В стерильные флаконы с образцами вносили по 2 мл питательной среды LB (контроль) или по 2 мл инокулума бактерий S. epidermidis ATCC 29887 в среде LB, содержащей 107 КОЕ/мл. Флаконы помещали в термостат (37oC) на 24 или 48 ч. По истечении выбранного срока инкубации планктонную культуру удаляли, таблетки переносили в стерильные флаконы, дважды аккуратно промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,2). Детекцию образовавшихся в процессе инкубации биопленок осуществляли двумя методами. Биомассу пленок определяли путем их окрашивания 0,1% раствором ген- циановым фиолетовым с последующей экстракцией связавшегося красителя 96% этанолом в течение 12 ч и измерением оптической плотности (OD) спиртового экстракта на спектрофотометре PD-303 (Япония) при длине волны 570 нм. Количество жизнеспособных клеток в биопленках определяли по уровню восстановления водорастворимого тетразолия в системе Cell Proliferation Assay (“Promega”, США) при 490 нм, который оценивали по прописи фирмы- производителя. Все исследования проведены троекратно [7]. Для повышения корректности сравнения полученных экспериментальных данных их выражали в условных единицах (усл. ед.), отражавших отношение OD растворов генцианового фиолетового или формазана (восстановленного тетразолия) на 1 см2 поверхности таблеток обоих составов. Результаты, характеризующие неспецифическую сорбцию генцианового фиолетового и формазана образцами модифицированных циркониевых таблеток, вычитали из данных, полученных при определении динамики роста биопленок. Результаты и обсуждение Исследование процессов формирования бактериальных пленок на поверхности диоксида циркония, стабилизированного ZrO2-3Y2O3 и ZrO2-15CeO2, пока- Жизнеспособность Биомасса пленок -Д- Неспецифическое связывание формазана -О- Неспецифическое связывание генцианового фиолетового Рис. 1. Динамика роста биопленок S. epidermidis ATCC 29 887 на таблетках диоксида циркония, стабилизированного ZrO2-15CeO2 (а) и ZrO2-3Y2O3 (б). зало выраженную зависимость биологических характеристик этих процессов от вида используемых добавок. Полученные результаты представлены на рис. 1. Таблетки из ZrO2-15CeO2, как показывают экспериментальные данные, обладают значительно менее выраженной неспецифической сорбцией использованных для детекции биологических свойств бактериальных пленок специальных красителей - генциа- нового фиолетового и тетразолия. Образующиеся на этом типе таблеток бактериальные пленки обладают в оба срока наблюдения и значительно меньшей биомассой, и жизнеспособностью по сравнению с пленками на таблетках диоксида циркония, стабилизированного ZrO2-3Y2O3. На рис. 2 представлены СЭМ-изображения образцов ZrO2-15CeO2 до и после инкубации биопленок. На рис. 2, б четко фиксируется спиралевидная структура агломератов, образующих поверхность материала. Обычно такая структура на образцах диоксида циркония, стабилизированного ZrO2-15CeO2, хорошо выделяется при относительно свободной укладке агломератов наночастиц, например в условиях гелевого литья образцов [8], но значительно хуже видна при получении образцов методом полусухого прессования. Спиралевидная структура указывает на иерархическое строение спекшихся агломератов и материала в целом. Появление такой структуры, возможно, имеет значение для формирования бактериальных пленок и при отсутствии деструкции поверхности такого материала. На рис. 3 показаны СЭМ-изображения поверхности образцов ZrO-3Y2O3 после инкубации биопленок. Агломераты бактерий, сформированные на этом материале, характеризуются меньшими размерами и округлой формы. Видимые изменения в самих агломератах после возникновения биопленок отсутствуют, однако на снимках зафиксированы образования квадратной (преимущественно) или треугольной формы размером 200-250 нм. Образования почти прозрачные или очень тонкие, но в них можно выделить полосчатую структуру типа структур Лизеганга (рис. 3, б). Наличие таких образований позволяет предполагать взаимодействие микробной пленки с материалом и его растворение-переосаждение в ходе этого взаимодействия. Возможно, выявленные образования возникают в местах прикрепления отдельных микроорганизмов к поверхности. На рис. 4 представлены КР-спектры поверхности образцов до и после инкубации биопленок. Спектры последних не отличаются от спектров исходных образцов, что позволяет сделать вывод о неизменности кристаллического Рис. 2. СЭМ-изображения поверхности образцов ZrO2-15CeO2 до (а) и после (б) инкубации биопленок. Ув. 15 000 и 20 000. Рис. 3. СЭМ-изображения поверхности образцов ZrO2-3Y2O3 после инкубации биопленок. Ув. 34 000 и 65 000. состава поверхности, в частности не зафиксировано появление моноклинной модификации диоксида циркония, так называемая расстабилизация поверхности материала. Данные о шероховатости поверхности исходных образцов приведены на рис. 5. Образцы состава ZrO2-15CeO2 отличаются большей шероховатостью, однако разница очень незначительна и не оказывает какого-либо влияния на взаимодействие микробной пленки с поверхностью. 318 314 261 251 147 141 700 600 500 400 300 Волновое число, см-1 200 100 Рис. 4. КР-спектры поверхности образцов ZrO2-15CeO2 (1, 2) и ZrO2-3Y2O3 (3, 4) до (1, 3) и после (2, 4) инкубации биопленок. 1 1 1 1 0 2000 6000 10 000 14 000 18 000 4000 8000 12 000 16 000 20 000 Размер области, нм Рис. 5. Зависимость средней шероховатости поверхности образцов составов ZrO2-15CeO2 (1) и ZrO2-3Y2O3 (2) от размеров области измерения. Таким образом, исследование стабилизированных ZrO2-3Y2O3 и ZrO2-15CeO2 образцов диоксида циркония до и после инкубации биопленки показало, что поверхность образцов состава ZrO2-15CeO2, по- видимому, подвержена меньшей атакуемости бактериальными клетками и как следствие образованию и росту на ней биопленок S. epidermidis ATCC 29887. При этом формирующаяся биопленка микроорганизмов, по-видимому, способствует самоорганизации элементов поверхности с образованием спиралевидных структур. Проведенные ранее исследования [9] показали, что под воздействием агрессивных сред (кислых и щелочных растворов) происходит незначительное растворение ZrO2-15CeO2, что может способствовать снижению интенсивности образования биопленок на поверхности, так как ZrO2-15CeO2 известен как биологически активный материал [10]. В отличие от обнаруженных закономерностей формирования бактериальных пленок на поверхностях ZrO2-15CeO2, биопленки на поверхностях образцов ZrO2-3Y2O3 имеют более высокую биомассу и жизнеспособность. Заключение Исследование процессов формирования биопленок коагулазонегативных стафилококков Staphylococcus epidermidis ATCC 29887 на поверхности диоксида циркония, стабилизированного оксидом иттрия и диоксидом церия, показало выраженную зависимость биологических характеристик этих процессов от вида стабилизирующей добавки. Биопленки на поверхности диоксида циркония, стабилизированного диоксидом церия, обладают значительно меньшей биомассой и жизнеспособностью их клеточных элементов по сравнению с пленками на поверхности диоксида циркония, стабилизированного оксидом иттрия. Таким образом, проведенные экспериментальные исследования воздействия микробных пленок S. epidermidis ATCC 29887 на поверхность диоксида циркония, стабилизированного диоксидом церия, свидетельствуют о целесообразности соответствующих клинических испытаний.

About the authors

A. G Rogozhnikov

Acad. E.A. Wagner Perm state medical Academy, Ministry of health of Russia

614990, Perm

G. I Rogozhnikov

Acad. E.A. Wagner Perm state medical Academy, Ministry of health of Russia

614990, Perm

S. E Morozova

Perm national research Polytechnic University

614990, Perm, Russia

V. P Korobov

Institute of ecology and genetics of microorganisms, Federal Agency of scientific organizations

614081, Perm,Russia

L. M Lemkina

Institute of ecology and genetics of microorganisms, Federal Agency of scientific organizations

614081, Perm,Russia

Oksana Aleksandrovna Shulyatnikova

Acad. E.A. Wagner Perm state medical Academy, Ministry of health of Russia

Email: anasko06@mail.ru
614990, Perm

A. A Gurov

Perm national research Polytechnic University

614990, Perm, Russia

I. A Morozov

Institute of continuous media mechanics Ural branch of the RAS

614013, Perm

References

Supplementary files