Микробные пленки Staphylococcus epidermidis ATCC 29887 на поверхности диоксида циркония. Экспериментальное исследование

Полный текст

Введение Материалы, используемые в ортопедической стоматологии для изготовления имплантатов, должны обладать не только комплексом физико-механических характеристик, но и параметрами биоинертности к тканям пациента и его сапрофитной микрофлоре. Так, ротовая полость является местом жизнедеятельности разнообразных микроорганизмов [1], в том числе патогенных, способных формировать на поверхностях конструкционных материалов особые многослойные биологические структуры, представляющие собой специфические сообщества микроорганизмов - бактериальные пленки [2]. Такие пленочные структуры не только изолируют вводимый чужеродный материал от тканей организма, но и могут вызывать патологические процессы [3, 4], которые приводят к развитию осложнений и хронизации воспалительных заболеваний при установке имплантационных систем и зубных протезов. Активными образователями биопленок являются коагулазонегативные стафилококки вида Staphylococcus epidermidis, представители которого известны как наиболее частые возбудители нозокомиального сепсиса и инфекций, ассоциированных с полимерными и металлическими имплантируемыми устройствами [5]. На современном этапе развития ортопедической стоматологии в качестве материала для изготовления имплантационных систем и зубных протезов широко используется диоксид циркония. Однако в литературе до сих пор отсутствуют данные (помимо результатов физико-механических испытаний) о влиянии различных стабилизирующих добавок в композитах циркония на эксплуатационные характеристики изделий из этого материала и атакуемости их поверхностей сапрофитной бактериальной микрофлорой. Цель работы - изучение образования и роста пленок Staphylococcus epidermidis ATCC 29887 на поверхности диоксида циркония, стабилизированного оксидами иттрия и церия. Материал и методы Образцы керамики для исследований получали на кафедре «Материалы, технологии и конструирование машин» Пермского национального исследовательского политехнического университета. Использовали нанопорошки диоксида циркония, стабилизированного 3 мол.% оксида иттрия (далее ZrO2-3Y2O3), производства фирмы «TOSOH” (Япония) и диоксида циркония, стабилизированного 15 мол.% диоксида церия (далее ZrO2-15CeO2), полученного в лабораторных условиях по золь-гель технологии с введением полимерных добавок [6]. Порошки компактировали методом полусухого прессования при давлении 200 МПа и спекали при изотермической выдержке при 1350oC. Получены образцы d = 7 мм и h = 1 мм. Фазовый состав образцов исследовали методом спектроскопии комбинационного рассеяния света (КР-спект- роскопии). КР-спектры получали на многофункциональном спектрометре комбинационного рассеяния света SENTERRA “Bruker” при длине волны излучающего лазера 532 нм и интенсивности излучения 5 mV. Микроструктуру материалов изучали методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на аналитическом автоэмиссионном растровом электронном микроскопе ULTRA 55 (‘^arl Zeiss”, Германия). Шероховатость образцов изучали на атомно-силовом микроскопе Dimension Icon (“VEECO”, США) в полуконтактном режиме работы прибора. Радиус острия зонда - 10 нм. Для исследований роста пленок S. epidermidis образцы диоксида циркония автоклавировали в индивидуальных стеклянных завинчивающихся флаконах при 121 oC в течение 60 мин. В стерильные флаконы с образцами вносили по 2 мл питательной среды LB (контроль) или по 2 мл инокулума бактерий S. epidermidis ATCC 29887 в среде LB, содержащей 107 КОЕ/мл. Флаконы помещали в термостат (37oC) на 24 или 48 ч. По истечении выбранного срока инкубации планктонную культуру удаляли, таблетки переносили в стерильные флаконы, дважды аккуратно промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,2). Детекцию образовавшихся в процессе инкубации биопленок осуществляли двумя методами. Биомассу пленок определяли путем их окрашивания 0,1% раствором ген- циановым фиолетовым с последующей экстракцией связавшегося красителя 96% этанолом в течение 12 ч и измерением оптической плотности (OD) спиртового экстракта на спектрофотометре PD-303 (Япония) при длине волны 570 нм. Количество жизнеспособных клеток в биопленках определяли по уровню восстановления водорастворимого тетразолия в системе Cell Proliferation Assay (“Promega”, США) при 490 нм, который оценивали по прописи фирмы- производителя. Все исследования проведены троекратно [7]. Для повышения корректности сравнения полученных экспериментальных данных их выражали в условных единицах (усл. ед.), отражавших отношение OD растворов генцианового фиолетового или формазана (восстановленного тетразолия) на 1 см2 поверхности таблеток обоих составов. Результаты, характеризующие неспецифическую сорбцию генцианового фиолетового и формазана образцами модифицированных циркониевых таблеток, вычитали из данных, полученных при определении динамики роста биопленок. Результаты и обсуждение Исследование процессов формирования бактериальных пленок на поверхности диоксида циркония, стабилизированного ZrO2-3Y2O3 и ZrO2-15CeO2, пока- Жизнеспособность Биомасса пленок -Д- Неспецифическое связывание формазана -О- Неспецифическое связывание генцианового фиолетового Рис. 1. Динамика роста биопленок S. epidermidis ATCC 29 887 на таблетках диоксида циркония, стабилизированного ZrO2-15CeO2 (а) и ZrO2-3Y2O3 (б). зало выраженную зависимость биологических характеристик этих процессов от вида используемых добавок. Полученные результаты представлены на рис. 1. Таблетки из ZrO2-15CeO2, как показывают экспериментальные данные, обладают значительно менее выраженной неспецифической сорбцией использованных для детекции биологических свойств бактериальных пленок специальных красителей - генциа- нового фиолетового и тетразолия. Образующиеся на этом типе таблеток бактериальные пленки обладают в оба срока наблюдения и значительно меньшей биомассой, и жизнеспособностью по сравнению с пленками на таблетках диоксида циркония, стабилизированного ZrO2-3Y2O3. На рис. 2 представлены СЭМ-изображения образцов ZrO2-15CeO2 до и после инкубации биопленок. На рис. 2, б четко фиксируется спиралевидная структура агломератов, образующих поверхность материала. Обычно такая структура на образцах диоксида циркония, стабилизированного ZrO2-15CeO2, хорошо выделяется при относительно свободной укладке агломератов наночастиц, например в условиях гелевого литья образцов [8], но значительно хуже видна при получении образцов методом полусухого прессования. Спиралевидная структура указывает на иерархическое строение спекшихся агломератов и материала в целом. Появление такой структуры, возможно, имеет значение для формирования бактериальных пленок и при отсутствии деструкции поверхности такого материала. На рис. 3 показаны СЭМ-изображения поверхности образцов ZrO-3Y2O3 после инкубации биопленок. Агломераты бактерий, сформированные на этом материале, характеризуются меньшими размерами и округлой формы. Видимые изменения в самих агломератах после возникновения биопленок отсутствуют, однако на снимках зафиксированы образования квадратной (преимущественно) или треугольной формы размером 200-250 нм. Образования почти прозрачные или очень тонкие, но в них можно выделить полосчатую структуру типа структур Лизеганга (рис. 3, б). Наличие таких образований позволяет предполагать взаимодействие микробной пленки с материалом и его растворение-переосаждение в ходе этого взаимодействия. Возможно, выявленные образования возникают в местах прикрепления отдельных микроорганизмов к поверхности. На рис. 4 представлены КР-спектры поверхности образцов до и после инкубации биопленок. Спектры последних не отличаются от спектров исходных образцов, что позволяет сделать вывод о неизменности кристаллического Рис. 2. СЭМ-изображения поверхности образцов ZrO2-15CeO2 до (а) и после (б) инкубации биопленок. Ув. 15 000 и 20 000. Рис. 3. СЭМ-изображения поверхности образцов ZrO2-3Y2O3 после инкубации биопленок. Ув. 34 000 и 65 000. состава поверхности, в частности не зафиксировано появление моноклинной модификации диоксида циркония, так называемая расстабилизация поверхности материала. Данные о шероховатости поверхности исходных образцов приведены на рис. 5. Образцы состава ZrO2-15CeO2 отличаются большей шероховатостью, однако разница очень незначительна и не оказывает какого-либо влияния на взаимодействие микробной пленки с поверхностью. 318 314 261 251 147 141 700 600 500 400 300 Волновое число, см-1 200 100 Рис. 4. КР-спектры поверхности образцов ZrO2-15CeO2 (1, 2) и ZrO2-3Y2O3 (3, 4) до (1, 3) и после (2, 4) инкубации биопленок. 1 1 1 1 0 2000 6000 10 000 14 000 18 000 4000 8000 12 000 16 000 20 000 Размер области, нм Рис. 5. Зависимость средней шероховатости поверхности образцов составов ZrO2-15CeO2 (1) и ZrO2-3Y2O3 (2) от размеров области измерения. Таким образом, исследование стабилизированных ZrO2-3Y2O3 и ZrO2-15CeO2 образцов диоксида циркония до и после инкубации биопленки показало, что поверхность образцов состава ZrO2-15CeO2, по- видимому, подвержена меньшей атакуемости бактериальными клетками и как следствие образованию и росту на ней биопленок S. epidermidis ATCC 29887. При этом формирующаяся биопленка микроорганизмов, по-видимому, способствует самоорганизации элементов поверхности с образованием спиралевидных структур. Проведенные ранее исследования [9] показали, что под воздействием агрессивных сред (кислых и щелочных растворов) происходит незначительное растворение ZrO2-15CeO2, что может способствовать снижению интенсивности образования биопленок на поверхности, так как ZrO2-15CeO2 известен как биологически активный материал [10]. В отличие от обнаруженных закономерностей формирования бактериальных пленок на поверхностях ZrO2-15CeO2, биопленки на поверхностях образцов ZrO2-3Y2O3 имеют более высокую биомассу и жизнеспособность. Заключение Исследование процессов формирования биопленок коагулазонегативных стафилококков Staphylococcus epidermidis ATCC 29887 на поверхности диоксида циркония, стабилизированного оксидом иттрия и диоксидом церия, показало выраженную зависимость биологических характеристик этих процессов от вида стабилизирующей добавки. Биопленки на поверхности диоксида циркония, стабилизированного диоксидом церия, обладают значительно меньшей биомассой и жизнеспособностью их клеточных элементов по сравнению с пленками на поверхности диоксида циркония, стабилизированного оксидом иттрия. Таким образом, проведенные экспериментальные исследования воздействия микробных пленок S. epidermidis ATCC 29887 на поверхность диоксида циркония, стабилизированного диоксидом церия, свидетельствуют о целесообразности соответствующих клинических испытаний.

Об авторах

А. Г Рогожников

ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России

614990, г. Пермь

Г. И Рогожников

ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России

614990, г. Пермь

С. Е Порозова

ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет»

614990, г. Пермь

В. П Коробов

ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО ФАНО

614081, г. Пермь

Л. М Лемкина

ФГБУН «Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО ФАНО

614081, г. Пермь

Оксана Александровна Шулятникова

ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России

Email: anasko06@mail.ru
614990, г. Пермь

А. А Гуров

ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет»

614990, г. Пермь

И. А Морозов

ФГБУН «Институт механики сплошных сред» УрО РАН

614013, г. Пермь

Список литературы

Дополнительные файлы