Пленкообразующая способность грибов рода Candida, выделенных со слизистой оболочки полости рта больных хроническим миелолейкозом

Полный текст

Введение Бактериальная биопленка - это сложноорганизованная форма существования адгезированных бактерий, продуцирующих внеклеточный матрикс и находящихся в разной степени дифференцировки по физиологическим, морфологическим, генетическим признакам. Их жизнедеятельность регулируется межклеточными сигнальными молекулами. Отсутствие хотя бы одного из вышеперечисленных признаков, характерных именно для биопленок, свидетельствует лишь о разной степени адгезии бактерий [6]. По данным Национального института здоровья (NIH) США, биопленки имеют большое клиническое значение, определяя более 80% инфекционных процессов в полости рта человека [1]. Практически все бактерии и грибы в ротовой полости человека образуют биопленки и входят в их состав. Свойства бактерий внутри сообщества значительно отличаются от таковых у изолированных клеток [1]. В биопленках по сравнению с планктонными культурами бактериальные клетки характеризуются измененным спектром экспрессии генов и обладают повышенной устойчивостью к факторам внешней среды, антимикробным химиопрепаратам, фагоцитозу. Биопленка представляет собой единый многоклеточный организм с присущим ему циклом развития, кооперативным поведением составляющих его особей, которое координируется системой Quorum Sensing (QS), основанной на продукции сигнальных молекул или аутоиндукторов и способности бактерий воспринимать эти сигналы [12]. Было показано, что эти сигнальные молекулы ингибируют пролиферацию Е-клеток и на фоне продолжающейся секреции интерлейкина 2 (ИЛ-2) обеспечивают цитостатический эффект, что в итоге способствует колонизации возбудителя, особенно в организме иммунокомпрометированных пациентов [7]. На процесс формирования биопленок и их свойства влияют факторы окружающей среды и макроорганизма, и наиболее важными из них являются физико-химические свойства (pH, соленость, осмолярность и т. д.), наличие питательных веществ, межклеточная коммуникация посредством специфических ауторегуляторов и др. [11, 17]. Образование биопленки является механизмом защиты от факторов агрессии внешней среды и иммунной системы человека, что позволяет рассматривать способность к образованию биопленок как один из факторов патогенности, который реализуется в определенных условиях [6]. Однако нередко биопленки формируются при колонизации слизистых оболочек различными патогенными потенциально патогенными микроорганизмами, в том числе Neisseria meningitides, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis и другими, что может привести к хроническому воспалению, маркерами которого являются наличие в очаге макрофагов, лимфоцитов, пролиферация соединительной ткани, накопление матрикс- ных протеинов и усиление ангиогенеза [5, 16]. Отдельного внимания заслуживают грибы рода Candida в составе биопленок. Являясь условно-патогенными микроорганизмами, вызывающими оппортунистическую инфекцию, особенно при наличии дефекта защиты организма, они образуют ассоциации с бактериями, усиливающими агрессивные свойства грибов. При формировании микстинфекции дрожжевые грибы находятся в симбиотических взаимоотношениях с разнообразными представителями грампозитивных и грамнега- тивных бактерий, а также других видов микромицетов [13]. Особо тяжелая клиническая картина присоединившейся вторичной инфекции наблюдается у пациентов с ослабленным иммунным статусом, в частности у страдающих хроническим миелолейкозом. Наиболее часто диагностируемым стоматологами осложнением у данной категории больных является кандидоз слизистой оболочки полости рта, особенно в период цитостатического лечения. Однако проводимая терапия кан- дидоза зачастую оказывается неэффективной, что может быть, во-первых, связано с наличием факторов устойчивости грибов рода Candida, в частности с их способностью к пленкообра- зованию, и во-вторых, выбор лекарственного препарата осуществляется без учета ассоциативных связей грибов Candida c другими представителями микробиоценоза полости рта. Так, бактерии, существующие в составе биопленок, в 100-1000 раз менее чувствительны к действию антимикробных химиопрепаратов, чем планктонные клетки того же вида [2, 4, 5]. У грибов, в частности у C. albicans, в 10-32 раза повышается устойчивость к амфотерецину В и в 2-4 раза к флуконазолу [14]. Более того, биопленочная инфекция редко устраняется иммунной системой хозяина: клетки в составе биопленок освобождают антигены, стимулируют продукцию антител и приобретают устойчивость к защитным механизмам. Иммунный ответ хозяина может даже стать причиной повреждения тканей самого хозяина, окружающих пораженный участок [15, 18]. Среди механизмов, лежащих в основе резистентности бактериальных биопленок, различные исследователи рассматривают инактивацию антибиотиков внеклеточными полимерами или ферментами; замедление метаболизма и скорости роста микроорганизмов в биопленке (что вызывает ускоренную диффузию из нее антибактериальных препаратов); экспрессию генов резистентности. Имеются также данные о наличии в биопленках особых «персистирующих» клеток, образующихся в определенной стадии роста культуры и обусловливающих повышенную устойчивость популяций к токсическим агентам и антимикробным веществам [3, 7, 8]. Большую роль в резистентности клеток биопленки к крупным белковым молекулам и антимикробным пептидам играет матрикс биопленки, который представляет собой диффузионный барьер для молекул антимикробных веществ [9]. Имеются также данные о том, что клетки в биопленке растут значительно медленнее, чем планктонные, и в результате этого медленнее усваивают антибактериальные препараты [2, 7]. Фактически все антибактериальные препараты более эффективны против быстро растущих клеток, а уменьшение метаболической активности и соответственно скорости роста и деления существенно влияет на восприимчивость микроорганизмов к действию антибактериальных агентов [10]. Однако рутинные методы определения чувствительности к антимикотическим препаратам, которые применяются для небиопленочных микробов, не могут дать адекватную оценку резистентности микробов, находящихся в глубоких слоях биопленок. Цель работы - исследовать пленкообразующую активность грибов рода Candida, выделенных со слизистой оболочки полости рта, и их антимикотикорезистентность у больных хроническим миелолейкозом и пациентов контрольной группы. Материал и методы Исследование проводилось на базе отделения гематологии №2 и микробиологического отдела клинико-диагностической лаборатории клиник ГБОУ ВПО СамГМУ. В ходе работы обследовано 30 больных хроническим миелолейкозом в возрасте от 27 до 78 лет, из них 19 мужчин и 11 женщин. Контрольную группу составили 15 человек с клиническими проявлениями кандидоза слизистой оболочки полости рта без патологии системы крови. В работе использованы микробиологический и микроскопический методы исследования. Сбор и транспортировку материала от пациентов осуществляли в соответствии с требованиями МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории». Сбор проб со слизистой оболочки ротовой полости проводили утром натощак после утреннего туалета ротовой полости ( чистки зубов пастой без бактерицидных или бактериостати- ческих добавок и ополаскивания рта теплой кипяченой водой). Для сбора материала использовали зонд-тампоны из транспортировочных пробирок со средами для хранения и транспортировки биологического материала для микробиологического исследования. Материал тщательно собирали сухим стерильным ватным зонд-тампоном со слизистой оболочки щек, основания языка и десен. Материал доставлялся в лабораторию в течение суток в изотермических условиях при комнатной температуре. Пленкообразующую способность грибов рода Candida определяли на пластиковых планшетах по следующей методике: культуры выращивали на кровяном агаре, суточные культуры переносили в лунки с пептонным бульоном (на 1 штамм - 1 планшет) (рис. 1 на вклейке), инкубировали 24 ч в термостате, замещали содержимое лунок 200 мкл 0,1% спиртового раствора фуксина и инкубировали при комнатной температуре 45 мин. Интенсивность окрашивания биопленки оценивали на фотоколориметре Пикон при длине волны 490 нм. Количественной оценкой степени образования биопленки были значения оптической плотности (рис. 2 на вклейке). Результаты и обсуждение В клинической группе больных хроническим миелолейко- зом диагноз кандидоза подтвержден лишь в 37% случаев, что указывает на значительное несоответствие типичной картины кандидоза слизистой оболочки полости рта данным микробиологического исследования. В контрольной группе подобное соответствие наблюдалось в 70% случаев. Полученные данные объясняют неэффективность проводимой антимикотической терапии и указывают на появление новой проблемы - своеобразной мимикрии бактериальной флоры полости рта. Исследование пленкообразующей активности грибов рода Candida у больных хроническим миелолейкозом позволило выявить их сравнительно низкую адгезивную способность (у всех штаммов, за исключением одного, показатели ниже 0,5), что говорит об отсутствии способности к образованию биопленок (рис. 3). На наш взгляд, подобное явление связано с угнетением неспецифической резистентности организма на фоне хронического миелолейкоза. Аналогичное исследование у пациентов контрольной группы выявило практически у всех штаммов показатели плотности выше 0,5, что говорит о способности грибов Candida образовывать биопленки с высокими адгезивными свойствами (рис. 4). Учитывая вышесказанное, вполне разумно сделать вывод о том, что у иммунокомпрометированных больных, в частности у больных хроническим миелолейкозом, при подозрении на кандидоз слизистой оболочки полости рта нет необходимости в дополнительном исследовании пленкообразующей способности грибов рода Candida. Тем самым одной современной проблемой у данной категории больных можно пренебречь и уделить внимание другой - несоответствию клинической картины кандидоза слизистой оболочки полости рта у больных хроническим миелолейкозом данным микробиологического исследования. Выделенные штаммы грибов рода Candida нуждаются в определении чувствительности к антимикотиче- ским препаратам. Выявленная же многочисленная негрибковая флора у данной категории больных требует исследования как пленкообразующей способности, так и чувствительности к антибактериальным препаратам.

Об авторах

В. П Кириллова

ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»

Кафедры стоматологии, терапевтической стоматологии, общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ИПО 443099, Самара

Т. М Ткач

ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»

Кафедры стоматологии, терапевтической стоматологии, общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ИПО 443099, Самара

А. В Лямин

ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»

Кафедры стоматологии, терапевтической стоматологии, общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ИПО 443099, Самара

Д. А Трунин

ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»

Кафедры стоматологии, терапевтической стоматологии, общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ИПО 443099, Самара

Анастасия Равильевна Серазетдинова

ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»

Email: serazetdinova-a@mail.ru
Кафедры стоматологии, терапевтической стоматологии, общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии ИПО 443099, Самара

Список литературы

Дополнительные файлы