МИКРОВАРИАНТ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИЛОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АЛЬФА-АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Полный текст

Введение Многочисленными исследованиями показано снижение активности различных ферментов слюны при патологических процессах в пародонте и твердых тканях зуба. Альфа-амилаза не является исключением [1, 2]. Известно, что от концентрации ферментов в сложных биологических растворах может зависеть их каталитическая активность. Изучение этой концентрации необходимо для определения степени тяжести стоматологической патологии и выбора правильной стратегии лечения [3]. Большинство способов определения каталитической активности альфа-амилазы основано на детекции способности фермента расщеплять субстрат, а именно крахмал, так как альфа-амилаза гидролизует 1,4-гликозидные связи в молекулах сложных углеводов [4]. Однако известны и другие подходы к оценке активности альфа-амилазы. Ряд авторов используют определение количества газа, выделяющегося в процессе реакции (манометрический метод), или фиксируют изменение оптического вращения (поляриметрический метод). Для количественного определения расщепленного ферментом субстрата (крахмала) применяют фотометры, которые позволяют изучить скорость ферментативной реакции по изменению поглощения субстрата при определенной длине волны [5]. Зачастую для реакций, входящих в данные методы, требуется большой объем реагентов и образцов, что затрудняет исследование слюны, особенно у большой группы людей одномоментно. С другой стороны, химическая промышленность выпускает альфа-амилазу в сухом виде, поэтому требуются методы определения каталитической активности растворов с различной концентрацией фермента при его растворении. Цель исследования - оценить возможность применения микроварианта реакции, определения активности альфа-амилазы слюны, а также проанализировать зависимость активности фермента от его концентрации. Материал и методы Активность альфа-амилазы определяли набором реагентов «АМИЛАЗА-ВИТАЛ» (Россия). Для экономии образцов и реагентов использовали полистироловый плоскодонный планшет для иммуноферментного анализа с объемом лунки 0,3 мл, а объем участников реакции пропорционально уменьшили. Дальнейшую процедуру анализа осуществляли согласно инструкции производителя. Для детекции окрашенного продукта применяли спектрофотометр PowerWave Х (США). Для определения концентрации альфа-амилазы использовали приготовленные ex tempore растворы альфа-амилазы (Россия) с концентрацией фермента 10; 5; 2,5; 1; 0,5 и 0,25 мг/мл соответственно. Пробы слюны в объеме 0,1 мл отбирали натощак у 15 человек в возрасте 20-25 лет с интактным пародонтом и зубным рядом без соматической патологии, согласно К.Н. Меньнику и соавт. [6]. Статистический анализ результатов выполняли с помощью t-критерия Стьюдента в программе Statistica 7.0. Результаты и обсуждение В первой серии экспериментов сравнивали результаты определения активности альфа-амилазы микропланшетным и классическим методами. Показано отсутствие статистически значимых различий (p > 0,05), что позволило нам использовать для дальнейших исследований только микропланшетный вариант. В ходе исследований выявлена прямая зависимость активности альфа-амилазы от следующих ее концентраций - 2,5; 1; 0,5; 0,25 и 0 мг/мл соответственно. Так, с увеличением концентрации фермента в 2 раза его каталитическая активность увеличивается более чем в 1,3 раза. Напротив, активность растворов фермента с концентраций выше 2,5 мг/мл начинает снижаться. Активность раствора альфа-амилазы с концентрацией фермента 5 мг/мл снижается более чем в 1,2 раза по сравнению с активностью данного фермента в концентрации 2,5 мг/мл. В свою очередь активность раствора с 10 мг/мл альфа-амилазы снижается более чем в 1,5 раза по сравнению с активностью данного фермента в растворе с концентрацией 5 мг/мл. Известно, что у здоровых людей активность альфа-амилазы слюны составляет в среднем 530 Е/л [7]. При использовании микропланшетного варианта реакции установлено, что активность фермента у 15 доноров с интактным пародонтом и зубным рядом без соматической патологии - 528,6 ± 2,4 Е/л. В целом, на современном этапе развития медицинской науки все большее предпочтение отдается микрообъемным вариантам классических реакций. Подобная ситуация позволяет увеличивать группы обследуемых лиц, проводить исследования одномоментно, а также использовать компьютерную обработку результатов. Предлагаемый микровариант реакции определения активности альфа-амилазы обладает всеми вышеперечисленными характеристиками. В ходе исследований показано, что в диапазоне концентрации альфа-амилазы 0-2,5 мг/мл ее активность нарастает, а при дальнейшем увеличении количества фермента его активность снижается. Подобное явление может быть обусловлено меньшей растворимостью насыщенного раствора и выпадением фермента в осадок, что необходимо учитывать при приготовлении растворов альфа-амилазы. Заключение Таким образом, показано, что предлагаемый микровариант определения активности альфа-амилазы может быть использован наряду с классическим вариантом реакции, обладает рядом преимуществ за счет увеличения числа проб для одномоментного исследования и снижения объемов, используемых реагентов. Выявлен диапазон концентраций альфа-амилазы (0-2,5 мг/мл), когда наблюдается прямая зависимость с активностью фермента.

Об авторах

А. П Годовалов

ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России

614000, Пермь, Россия

Михаил Владимирович Яковлев

ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России

Email: mikhailyak@mail.ru
студент стоматологического акультета ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России 614000, Пермь, Россия

И. И Задорина

ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России

614000, Пермь, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы