EXPEREMENTAL PREVENTION OF STRESS CHANGES OF TOOTH PULP TISSUES AND PERIODONTIUM WITH NITRIC OXIDE DONOR MOLECULES

全文:

Актуальность исследования. Важную роль в повреждении тканей пародонта играют стрессорные воздействия, так как в результате активации адренергической и гипоталамо-гипофизарно-адреналовой систем происходят нарушения углеводного обмена, чрезмерная активация процессов перекисного окисления липидов, расстройства регионарной гемодинамики, что приводит к деструкции клеточных мембран пародонтальных тканей [1]. Ф.З. Меерсоном была разработана концепция стресс-лимитирующих систем организма, которая дала реальную основу для разработки принципов предупреждения чрезмерной активности стресс-реакции и реализации ее патогенных воздействий на различные органы и системы организма [2]. В соответствии с концепцией Меерсона, формирование защитных эффектов адаптации обеспечивается активацией генетического аппарата и изменением метаболизма клеток, а также изменением функционирования практически всех основных систем организма: нервной, эндокринной, сердечно-сосудистой, дыхательной, мышечной и т. д. Поэтому очевидно, что в механизме адаптации наиболее важную роль играют универсальные факторы регуляции физиологических систем и экспрессии генов [2, 3]. Согласно современным представлениям, таким универсальным регулятором является оксид азота (NO) [4]. С начала 1990-х годов стали появляться очень важные доказательства того, что NO вовлечен в регуляцию активности генетического аппарата как на уровне 14 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ факторов транскрипции, так и на уровне самих механизмов транскрипции и трансляции мРНК [5, 6]. Наконец, после того как были получены данные о значительных изменениях в продукции NO при стрессе и в процессе адаптации к разным факторам, сразу возникло предположение о том, что NO играет важную роль в стрессорных и адаптивных ответах организма [7, 8]. Была выдвинута гипотеза о том, что NO участвует в регуляции стресс-реакции, ограничивая ее чрезмерную активацию и ее повреждающие эффекты как на центральном, так и на периферическом уровне [9]. Если эта гипотеза верна, то увеличение содержания NO, обусловленное, например, введением доноров NO, должно ограничить чрезмерную активацию стресс-системы, и наоборот, снижение мощности систем генерации NO, например, с помощью блокаторов NO-синтазы, должно приводить к увеличению повреждающих эффектов факторов среды. Цель исследования. Раскрыть закономерности и механизмы стрессорных изменений пульпы зубов и тканей пародонта, возникающих под влиянием эмоционально-болевого стресса, и разработать принципы их предупреждения в эксперименте путем использования активаторов и ингибиторов фермента NO-синтазы. Материалы и методы Опыты проведены на 168 белых крысах-самцах линии Vistar массой 180—220 г в осенне-зимний период. Все животные были разделены на 4 группы, соответствующие следующим сериям экспериментов: 1-ю группу (контрольную) составили животные для изучения исходного уровня кортикостерона, эозинофилов, строения пульпы зуба и тканей пародонта в норме (n = 6). 2-я группа — животные для изучения уровня кортикосте-рона, эозинофилов, состояния пульпы зуба и тканей пародон-та при эмоционально-болевом стрессе (n = 54). 3-я группа — животные для изучения уровня кортикосте-рона, эозинофилов, состояния пульпы зуба и тканей пародон-та при эмоционально-болевом стрессе в условиях использования донора молекул оксида азота (NO) L-аргинина (n = 54). 4-я группа — животные для исследования уровня корти-костерона, эозинофилов, морфологической картины пульпы зубов и тканей пародонта после стрессорного воздействия в условиях применения блокатора фермента NO-синтазы L-NNA (n = 54). Для морфологического анализа материал после фиксации в забуференном 10% нейтральном формалине проводился и заливался в парафин по общепринятой методике. Срезы стандартной толщины (5 мкм) окрашивались гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по Ван-Гизону. Морфометрическое исследование проводилось с использованием измерительной сетки со 100 равноудаленными точками Г.Г. Автандилова для цитогистостереометрических исследований, накладываемой на фотоснимок на экране монитора произвольно выбранного поля зрения [10]. Методом точечного счета определялись: относительный объем, занимаемый фибробластами, пульпоцитами, аморфным веществом, сосудами, коллагеновыми волокнами, сегментоядерными лейкоцитами. Подсчет производился в каждом случае в 20 различных полях зрения при увеличении микроскопа *100. Отдельно путем определений линейных размеров вычислялись среднее значение толщины слоя одон-тобластов (мкм), высоты одонтобластов, размеры пульпоци-тов. Средний диаметр сосудов вычислялся по совокупности перпендикулярных измерений большого и малого диаметров (мкм). Определялась также численная плотность одонтобластов на единицу площади (1000 мкм2). Поле зрения при увеличении микроскопа *100 составило 202 459,22 мкм2, при увеличении *400 — 11 685,37 мкм2. Полученные данные обрабатывались методом вариационной статистики с помощью программы Statistica 6.0 StatSoft. Достоверность различий между группами с независимыми количественными показателями определялась по ü-критерию Манна—Уитни для непараметрических величин. Уровень различий при р < 0,05 рассматривался как статистически значимый. Результаты исследования. Как показали результаты исследования уровня кортикостерона и эозино-филов в крови подопытных животных, реакция ги-поталамо-гипофизарно-адреналовой системы носит фазный характер (рис. 1). Первый период характеризуется увеличением концентрации кортикостерона и развитием эозинопении (от начала стрессорного воздействия до 39 ч). Второй (от 39 до 45 ч) — снижением концентрации корти-костерона и развитием выраженной эозинофилии. В третьем периоде после повторной кратковременной эозинопении колебания уровня эозинофилов в крови постепенно приближаются к исходному уровню, а концентрация кортикостерона вновь повышается (45—72 ч). Проведенные исследования позволили установить, что в динамике морфологических изменений пульпы зубов лабораторных животных достаточно четко определяются три стадии процесса повреждения и восстановления структуры пульпы зуба. Максимальной выраженности по степени и распространенности изменения структуры пульпы зубов и пародонта достигли к 45 часам после окончания стрессорного воздействия, что соответствует переходу стадии тревоги в стадию резистентности стресс-реакции. В пульпе зубов они характеризовались разрыхлением слоя одонтобластов, полнокровием, появлением мелких вакуолей. Одонтобласты в области разрыхления деформированы. Данные изменения соответствуют гидропической (вакуольной, водяночной) дистрофии. Размеры, количество и расположение вакуолей какой-либо системы не имели. В ряде полей зрения встречались группы гиперхромных одонтобластов, которые обнаруживались только в области шейки на язычной поверхности зуба. Основное вещество пульпы отличается очаговой базофилией и менее компактным расположением волокнистых структур, разделенных оптически пустыми более или менее широкими пространствами. Развившиеся преобразования свидетельствуют в пользу обратимой дезорганизации соединительной ткани — мукоидного набухания. Она имеет неравномерный характер, занимая не более трети площади пульпы в каждом зубе. Реакция кровеносных сосудов пульпы на стресс более демонстративна и отчетлива. В сравнении с группой контроля в пульпе резцов отмечено реактивное расширение сосудов и переполнение их кровью, особенно в субодонтобластическом слое. В связи с этим артерии, капилляры и вены коронковой части пульпы резко выделялись на фоне всей ткани (рис. 2 на вклейке). При морфологическом анализе тканей пародонта через 45 ч после окончания стрессорного воздействия установлено, что количество клеточных элементов 15 РОССИЙСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, №4, 2013 Jt> 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57 60 63 66 69 72 У//Л Кортикостерон -Эозинофилы Рис. 1. Содержание кортикостерона и эозинофилов у крыс в динамике при эмоциональноболевом стрессе. периодонта возрастает по направлению к верхушке корня зуба и от центра периодонтальной щели к поверхности цемента. Основную массу клеток периодонтальной щели составляют фибробласты. В ряде полей зрения в тканях пародонта в небольшом количестве появляются эозинофилы. Фибробласты имеют нечеткие контуры, мелкозернистые ядра. В отличие от группы сравнения вблизи мелких артерий выявлены единичные макрофаги, которые не содержат фагоцитированных частиц. Наряду с этим наблюдается миграция небольшого количества нейтрофильных лейкоцитов за пределы сосудов. В окружающей ткани определяется отек с увеличением пространств между коллагеновыми волокнами с некоторым набуханием последних. Возле сосудов видны единичные макрофаги, их цитоплазма содержит вакуоли и фагоцитируемые частицы (рис. 3 на вклейке). Подводя итог результатам морфологического исследования пульпы и пародонта крыс через 45 ч после окончания эмоционально-болевого воздействия, можно сделать вывод о развитии существенных ге-модинамических расстройств, вызванных стрессом. Они сводятся к неравномерному артериальному и венозному полнокровию, гемостазам, диапедезным кровоизлияниям, умеренным лейкодиапедезу и ма-крофагальной реакции. Выявленные структурные изменения являются обратимыми, без дальнейшей отрицательной динамики. Решая следующие задачи работы, нами были изучены возможности ограничения выраженности стрессорных повреждений тканей пульпы зубов и пародонта у животных с помощью оксида азота (NO) путем введения доноров и блокаторов фермента NO-синтазы. Было установлено, что слой одонтобластов в пульпе зубов крыс третьей группы состоит из нескольких слоев. Форма одонтобластов преимущественно грушевидная, цитоплазма базофильная, мелкозернистая, ядра вытянутые и округлые. В части полей зрения в пульпе резцов в области шейки с язычной поверхности зуба определяются немногочисленные одонтобласты с заметно гиперхромными ядрами. Дистрофические изменения одонтобластов в виде гипергидратации содержимого клетки морфологиче ски проявляются в наличии в их цитоплазме немногочисленных мелких вакуолей. Эти изменения носят локальный и менее распространенный характер в сравнении со второй группой. Соответственно этим участкам слой одонтобластов разрыхлен, не имеет четкой границы, полнокровен. Состав, распределение и количество клеточных элементов центральных отделов пульпы мало отличается от группы сравнения. В артериях полнокровие имеет умеренную степень выраженности, сопровождаясь утолщением эндотелия (рис. 4 на вклейке). Во всех случаях имеет место умеренная транссудация жидкой части крови в основное вещество пульпы, что приводит к отеку. Вне участков отека волокнистые структуры по расположению и тинкториаль-ным свойствам не имели морфологических отличий от таковых в пульпе контрольных животных. В тканях пародонта после стресса на фоне введения молекул оксида азота — L-аргинина наблюдается формирование сосудистого и клеточного ответа. Сосуды пародонта были расположены типично для нормального состояния периодонта, т. е. ближе к стенке альвеолы. Эндотелий сосудов — без признаков дезорганизации, ядра эндотелиальных клеток по структуре не отличаются от контроля. Отмечаются присущие всем наблюдениям исследуемых групп полнокровие, диапедезные кровоизлияния и гемостазы. Однако после стрессорного воздействия кровенаполнение сосудов имеет неравномерный, преимущественно умеренный характер. Целостность эндотелиальной выстилки сосудов не нарушена. В сосудах костных каналов эндотелий не изменен, сосуды содержат обычные форменные элементы крови. Изменения клеточного состава характеризовались увеличением размера небольшого числа фибробластов, ядра которых были четко очерчены, цитоплазма — легкобазофильна. Вблизи цемента больше молодых фибробластов с нечетко контурирующейся цитоплазмой и овальной формы ядрами. Вокруг кровеносных сосудов расположены единичные лимфоциты, плазмо-циты, нейтрофилы, эозинофилы (рис. 5 на вклейке). Граница между остеонным и безостеонным слоями альвеолы четкая. Коллагеновые волокна в участках па-родонта, расположенных ближе к маргинальному отделу, отличаются набуханием, появлением между ними пространств вследствие отека. Отек значительно меньше, чем в контрольной группе. При этом тинкториаль-ные свойства коллагеновых волокон сохраняются. В процессе проведенного анализа в четвертой группе животных (на фоне введения блокатора NO-синтазы L-NNA) морфологические изменения выявлены во всех структурных компонентах пульпы и пародонта. Слой одонтобластов на большем протяжении имеет неравномерную толщину, разрыхлен, не обладая 16 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Таблица 1 Морфометрические показатели пульпы зуба крысы при эмоционально-болевом стрессе (M ± m) Структурные компоненты Контроль* Через 45 ч после эмоциональноболевого воздействия, % Через 45 ч после эмоционально-болевого воздействия на фоне введения донора молекул оксида азота — L-аргинина, % Через 45 ч после эмоционально-болевого воздействия на фоне введения блокатора фермента NO-синтазы — L-NNA, % Пульпоциты 14,7 ± 0,49 10,9 ± 1,71 12,2 ± 1,22 7,65 ± 0,98 Аморфное вещество 31,4 ± 0,54 40,1 ± 0,83 34,6 ± 0,73 38,45 ± 0,91 Сосуды 13,1 ± 0,77 19,5 ± 0,65 16,3 ± 0,67 29,7 ± 0,74 Коллагеновые волокна и фибробласты 40,8 ± 0,74 29,2 ± 0,62 36,7 ± 0,58 23,6 ± 0,55 Сегменто-ядерные лейкоциты 0 0,3 ± 1,31 0,2 ± 1,23 0,6 ± 1,54 Количество одонтобластов 8,5 ± 1,87 8,1 ± 1,24 8,2 ± 1,24 6,2 ± 0,53 Толщина слоя одонтобластов, мк 22,3 ± 1,5 23,8 ± 2,35 20,7 ± 1,24 28,9 ± 1,37 Высота одонтобластов, мк 11,4 ± 1,11 13,9 ± 2,08 9 ± 2,24 13,5 ± 1,03 Диаметр сосуда 24,8 ± 2,05 32,3 ± 1,04 29,6 ± 1,24 35,4 ± 1,06 Примечание. относительный удельный объем. * четкими границами, сливается с субодонтобластиче-ским слоем. Одонтобласты в участках разрыхления деформированы, приобретают чрезмерно вытянутую и неправильную форму. Во многом это связано с многочисленными вакуолями, располагающимися преимущественно в базальной части клеток. Вакуоли округлой формы, имеют различную величину, местами сливаясь, формируют относительно крупные полости, выступающие за пределы слоя одонтобластов (баллонная дистрофия) (рис. 6 на вклейке). В центральной части пульпы клыков и резцов отмечается ярко выраженная сосудистая реакция в виде расширения сосудов и их полнокровия, как в основных магистральных стволах, так и в мелких ветвях прекапиллярного и капиллярного типа. В просветах капилляров и венул располагаются формирующие "монетные столбики" эритроциты. Кровоизлияния занимают 9,3% площади среза. В результате этого часть пучков коллагеновых волокон, расположенных в центральных отделах пульпы, разволокнена, а строма в целом имеет неравномерную плотность. В этих полях зрения волокнистые структуры изменяют тинкто-риальные свойства в сторону базофилии, что служит проявлением мукоидного набухания. Пучки волокон располагаются вдоль оси зуба или под небольшим углом к ней. Повышение сосудистой проницаемости не ограничивается транссудацией жидких составных элементов крови. Эмиграция лейкоцитов подтверждается наличием их небольшого количества вблизи сосудов центральной части пульпы. Здесь определяются макрофаги, в цитоплазме которых имелись мелкие вакуоли. Макрофагальная реакция, выявленная у 57,5% животных, характеризуется увеличением числа макрофагов в сравнении с другими группами. При морфологическом исследовании пародон-та крыс, подвергшихся стрессорному воздействию на фоне введения блокатора фермента NO-синтазы, установлено, что, так же как в контрольной группе, пучки коллагеновых волокон периодонта располагаются разнонаправленно. Кровеносные сосуды располагаются как параллельно длинной оси зуба, так и в виде спирали вокруг корня (рис. 7 на вклейке). Основные клетки периодонтальной щели — фибробласты — имеют преимущественно веретенообразную и отростчатую форму, обладают нечеткими границами, мелкозернистой цитоплазмой. Наблюдается отек, местами выраженный, периодонтальной связки. В половине наблюдений отмечается умеренно выраженная макрофагальная реакция с образованием небольших групп макрофагов, которые содержат вакуоли и фагоцитируемые частицы. Изменения в костной ткани альвеол проявляются нечетким набуханием безостеонного слоя. Кровеносные сосуды гаверсовых каналов резко полнокровны (рис. 8 на вклейке). С целью объективизации полученных результатов в тканях пульпы и пародонта крыс при изучаемых вариантах стрессового воздействия был осуществлен морфометрический анализ (табл. 1, 2). Цифровые по- Таблица 2 Морфометрические показатели пародонта крысы при эмоционально-болевом стрессе (M ± т) Структурные компоненты, % Через 45 ч после стрес-сорного воздействия, % Через 45 ч после стрессорно-го воздействия на фоне введения донора молекул оксида азота — L-аргинина, % Через 45 ч после стрессор-ного воздействия на фоне введения блокатора фермента NO-синтазы — L-NNA, % Аморфное вещество 25,9 ± 0,45 31,4 ± 0,35 Сосуды 7,8 ± 0,81 14,9 ± 0,43 Коллагеновые волокна и фибробласты 66,3 ± 0,47 53,6 ± 0,48 Сегменто-ядерные лейкоциты 0 0,1 ± 1,13 28.5 ± 0,54 10,8 ± 0,69 60.5 ± 0,32 0,2 ± 1,14 37,6 ± 0,39 21,4 ± 0,69 40,8 ± 0,69 0,2 ± 1,69 Примечание. относительный удельный объем. * 17 РОССИЙСКИЙ СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, №4, 2013 казатели не противоречат выявленным качественным изменениям. Таким образом, сравнительный анализ выявленных структурных изменений тканей пульпы и паро-донта в условиях активации стресс-лимитирующих систем и группы контроля позволил сделать следующие выводы: 1. В пульпе и пародонте крысы через 45 ч после стрессорного воздействия на фоне введения аминокислоты L-аргинина развиваются очаговая дистрофия одонтобластов, а также сосудистые реакции в виде неравномерного полнокровия, немногочисленных гемостазов, слабо выраженного лейкодиапедеза, участков отека. Индуцированная активация фермента NO-синтазы позволила свести к минимуму гемодина-мические расстройства и вызванные этим повреждения структурных компонентов исследуемых тканей. 2. В пульпе и пародонте крыс, подвергшихся стрессорному воздействию на фоне введения бло-катора фермента NO-синтазы, развиваются очаги повреждения в слое одонтобластов и эндотелии сосудов с гибелью части их клеток. Гемодинамические расстройства сопровождаются распространенными гемостазами, различных размеров кровоизлияниями, отеком, лейкодиапедезом и макрофагальной реакцией. Данные изменения имеют более выраженный, чем в других исследуемых группах, характер, являясь частью необратимыми. В целом представленные выше данные показали принципиальную возможность влияния с помощью доноров NO и блокаторов синтеза NO на стрессорные ответы организма.

作者简介

E. Yermak

T. Maters

E. Panina

E. Ananyina

T. Rodionova

I. Zotova

参考

补充文件