Точечные мутации V546E и D547H в мотиве RBM-B не влияют на связывание праймазы-полимеразы PrimPol с репликативным белком А и ДНК

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Праймаза-полимераза PrimPol человека – ключевой участник механизма реинициации синтеза ДНК при остановке репликативной вилки на поврежденных участках. PrimPol обладает ДНК-праймазной активностью и синтезирует ДНК-праймеры, которые используются процессивными ДНК-полимеразами для продолжения репликации. Привлечение PrimPol к поврежденному участку ДНК, а также активация каталитической активности PrimPol происходят за счет взаимодействия с репликативным белком А (RPA), связывающим оцДНК. В С-концевом домене PrimPol расположен отрицательно заряженный мотив связывания с RPA (RBM, RPA-binding motif), мутации которого нарушают взаимодействие двух белков. Мотив RBM участвует также в негативной регуляции взаимодействия PrimPol c ДНК. Делеция RBM резко повышает аффинность PrimPol к ДНК и активность PrimPol. Механизм опосредованной RBM регуляции активности PrimPol не установлен. Свой вклад во взаимодействие PrimPol c RPA и ДНК потенциально может вносить относительно сильный отрицательный заряд RBM. В RBM можно отдельно выделить участки RBM-A и RBM-B. В представленной работе мы дополнительно добавили (замена V546E) или понизили (замена D547H) отрицательный заряд в RBM-B PrimPol и биохимически охарактеризовали мутантные варианты. Показано, что локальное изменение заряда RBM-B не влияет на взаимодействие PrimPol с ДНК и RPA, а также на каталитическую активность фермента.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. А. Манукян

Научно-исследовательский центр “Курчатовский институт”

Email: lizaboldinova@yandex.ru
Россия, Москва, 123182

А. В. Макарова

Научно-исследовательский центр “Курчатовский институт”; Институт биологии гена Российской академии наук

Email: lizaboldinova@yandex.ru
Россия, Москва, 123182; Москва, 119334

Е. О. Болдинова

Научно-исследовательский центр “Курчатовский институт”; Институт биологии гена Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: lizaboldinova@yandex.ru
Россия, Москва, 123182; Москва, 119334

Список литературы

  1. García-Gómez S., Reyes A., Martínez-Jiménez M.I., Chocrón S., Mourón S., Terrados G., Powell C., Salido E., Méndez J., Holt I.J., Blanco L. (2013) PrimPol, an archaic primase/polymerase operating in human cells. Mol. Cell. 52, 541–553.
  2. Bianchi J., Rudd S.G., Jozwiakowski S.K., Bailey L.J., Soura V., Taylor E., Stevanovic I., Green A.J., Stracker T.H., Lindsay H.D., Doherty A.J. (2013) Primpol bypasses UV photoproducts during eukaryotic chromosomal DNA replication. Mol. Cell. 52, 566–573.
  3. Wan L., Lou J., Xia Y., Su B., Liu T., Cui J., Sun Y., Lou H., Huang J. (2013) HPrimpol1/CCDC111 is a human DNA primase-polymerase required for the maintenance of genome integrity. EMBO Rep. 14, 1104–1112.
  4. Iyer L.M., Koonin E.V., Leipe D.D., Aravind L. (2005) Origin and evolution of the archaeo-eukaryotic primase superfamily and related palm-domain proteins: structural insights and new members. Nucl. Acids Res. 33, 3875–3896.
  5. Martínez-Jiménez M.I., Calvo P.A., García-Gómez S., Guerra-González S., Blanco L. (2018) The Zn-finger domain of human PrimPol is required to stabilize the initiating nucleotide during DNA priming. Nucl. Acids Res. 46, 4138–4151.
  6. Schiavone D., Jozwiakowski S.K., Romanello M., Guilbaud G., Guilliam T.A., Bailey L.J., Sale J.E., Doherty A.J. (2016) PrimPol is required for replicative tolerance of G quadruplexes in vertebrate cells. Mol. Cell. 61, 161–169.
  7. Mehta K.P.M., Thada V., Zhao R., Krishnamoorthy A., Leser M., Rose K.L., Cortez D. (2022) CHK1 phosphorylates PRIMPOL to promote replication stress tolerance. Sci. Adv. 8, eabm0314.
  8. Guilliam T.A., Jozwiakowski S.K., Ehlinger A., Barnes R.P., Rudd S.G., Bailey L.J., Skehel J.M., Eckert K.A., Chazin W.J., Doherty A.J. (2015) Human PrimPol is a highly error-prone polymerase regulated by single-stranded DNA binding proteins. Nucl. Acids Res. 43, 1056–1068.
  9. Guilliam T.A., Brissett N.C., Ehlinger A., Keen B.A., Kolesar P., Taylor E., Bailey L.J., Lindsay H.D., Chazin W.J., Doherty A.J. (2017) Molecular basis for PrimPol recruitment to replication forks by RPA. Nat. Commun. 8, 15222.
  10. Martínez-Jiménez M.I., Lahera A., Blanco L. (2017) Human PrimPol activity is enhanced by RPA. Sci. Rep. 7, 783.
  11. Bailey L.J., Bianchi J., Hégarat N., Hochegger H., Doherty A.J. (2016) PrimPol-deficient cells exhibit a pronounced G2 checkpoint response following UV damage. Cell Cycle. 15, 908–918.
  12. Bailey L.J., Bianchi J., Doherty A.J. (2019) PrimPol is required for the maintenance of efficient nuclear and mitochondrial DNA replication in human cells. Nucl. Acids Res. 47, 4026–4038.
  13. Kobayashi K., Guilliam T.A., Tsuda M., Yamamoto J., Bailey L.J., Iwai S., Takeda S., Doherty A.J., Hirota K. (2016) Repriming by PrimPol is critical for DNA replication restart downstream of lesions and chain-terminating nucleosides. Cell Cycle. 15, 1997–2008.
  14. Mourón S., Rodriguez-Acebes S., Martínez-Jiménez M.I., García-Gómez S., Chocrón S., Blanco L., Méndez J. (2013) Repriming of DNA synthesis at stalled replication forks by human PrimPol. Nat. Struct. Mol. Biol. 20, 1383–1389.
  15. Zhao F., Wu J., Xue A., Su Y., Wang X., Lu X., Zhou Z., Qu J., Zhou X. (2013) Exome sequencing reveals CCDC111 mutation associated with high myopia. Hum. Genet. 132, 913–921.
  16. Keen B.A., Bailey L.J., Jozwiakowski S.K., Doherty A.J. (2014) Human PrimPol mutation associated with high myopia has a DNA replication defect. Nucl. Acids Res. 42, 12102–12111.
  17. Kasamo K., Nakamura M., Daimou Y., Sano A. (2020) A PRIMPOL mutation and variants in multiple genes may contribute to phenotypes in a familial case with chronic progressive external ophthalmoplegia symptoms. Neurosci. Res. 157, 58–63.
  18. Yuan H., Wang Q., Li Y., Cheng S., Liu J., Liu Y. (2020) Concurrent pathogenic variants in SLC6A1/NOTCH1/PRIMPOL genes in a Chinese patient with myoclonic-atonic epilepsy, mild aortic valve stenosis and high myopia. BMC Med. Genet. 21, 93.
  19. Duong V.N., Zhou L., Martínez-Jiménez M.I., He L., Cosme M., Blanco L., Paintsil E., Anderson K.S. (2020) Identifying the role of PrimPol in TDF-induced toxicity and implications of its loss of function mutation in an HIV+patient. Sci. Rep. 10, 9343.
  20. Díaz-Talavera A., Calvo P.A., González-Acosta D., Díaz M., Sastre-Moreno G., Blanco-Franco L., Guerra S., Martínez-Jiménez M.I., Méndez J., Blanco L. (2019) A cancer-associated point mutation disables the steric gate of human PrimPol. Sci. Rep. 9, 1121.
  21. Quinet A., Tirman S., Jackson J., Šviković S., Lemaçon D., Carvajal-Maldonado D., González-Acosta D., Vessoni A.T., Cybulla E., Wood M., Tavis S., Batista L.F.Z., Méndez J., Sale J.E., Vindigni A. (2019) PRIMPOL-mediated adaptive response suppresses replication fork reversal in BRCA-deficient сells. Mol. Cell 77, 461–474.
  22. Keen B.A., Jozwiakowski S.K., Bailey L.J., Bianchi J., Doherty A.J. (2014) Molecular dissection of the domain architecture and catalytic activities of human PrimPol. Nucl. Acids Res. 42, 5830–5845.
  23. Rechkoblit O., Gupta Y.K., Malik R., Rajashankar K.R., Johnson R.E., Prakash L., Prakash S., Aggarwal A.K. (2016) Structure and mechanism of human PrimPol, a DNA polymerase with primase activity. Sci. Adv. 2, e1601317.
  24. Boldinova E.O., Baranovskiy A.G., Gagarinskaya D.I., Manukyan А.А., Makarova A.V., Tahirov T.H. (2023) The role of catalytic and regulatory domains of human PrimPol in DNA binding and synthesis. Nucl. Acids Res. 51, 7541–7551.
  25. Boldinova E.O., Stojkovic G., Khairullin R., Wanrooij S., Makarova A.V. (2017) Optimization of the expression, purification and polymerase activity reaction conditions of recombinant human PrimPol. PLoS One. 12, e0184489.
  26. Binz S.K., Dickson A.M., Haring S.J., Wold M.S. (2006) Functional assays for replication protein A (RPA). Methods Enzymol. 409, 11–18.
  27. Болдинова Е.О., Макарова А.В. (2023) Регуляция ДНК-праймазы-полимеразы PrimPol человека. Биохимия. 88, 1392–1411.
  28. Boldinova E.O., Belousova E.A., Gagarinskaya D.I., Maltseva E.A., Khodyreva S.N., Lavrik O.I., Makarova A.V. (2020) Strand displacement activity of primpol. Int. J. Mol. Sci. 21, 9027.
  29. Boldinova E.O., Ghodke P.P., Sudhakar S., Mishra V.K., Manukyan A.A., Miropolskaya N., Pradeepkumar P.I., Makarova A.V. (2022) Translesion synthesis across the N2-ethyl-deoxyguanosine adduct by human PrimPol. ACS Chem. Biol. 17, 3238–3250.
  30. Liu H., Naismith J.H. (2008) An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Приложение
Скачать (677KB)
Метаданные
3. Рис. 1. Сравнение каталитической активности PrimPol дикого типа и вариантов V546E и D547H. а – Выравнивание аминокислотных последовательностей RBM-A и RBM-B PrimPol из организмов разных таксонов. Красным отмечены отрицательно заряженные остатки Asp и Glu. Оранжевыми звездами отмечены остатки PrimPol, образующие связи с субъединицей RPA70, согласно структуре [9]. б – ДНК-полимеразная активность PrimPol и вариантов с заменами V546E и D547H. Реакции проводили в присутствии 20/50/100/200/400/800 нМ PrimPol в течение 10 мин. в – ДНК-полимеразная активность PrimPol и ее вариантов в зависимости от времени реакции, а также значения параметра kobs. Реакции проводили в присутствии 200 нМ PrimPol в течение 2/5/10/30/60/120 мин. г – Общая ДНК-праймазная активность PrimPol и вариантов с заменами V546E и D547H. Реакции проводили в присутствии [γ-32P]ATP, ATP, dGTP и dTTP в течение 30/60/90 мин. д – Образование динуклеотида PrimPol дикого типа и вариантами V546E и D547H. Реакции проводили в присутствии [γ-32P]ATP, ATP и dGTP в течение 30 мин.

Скачать (761KB)
Метаданные
4. Рис. 2. Анализ сдвига комплекса PrimPol дикого типа и вариантов с заменами V546E и D547H с ДНК в нативном геле. Представлены средние значения и стандартные ошибки.

Скачать (317KB)
Метаданные
5. Рис. 3. Анализ влияния замен V546E и D547H на взаимодействие PrimPol с репликативным белком RPA. а – Образование тройного комплекса RPA:ДНК:PrimPol в 5%-ном нативном геле. б –Электрофореграмма реакций удлинения праймера. ДНК-полимеразные реакции проводили в присутствии 100 нМ PrimPol или ее вариантов в течение 5/10/30 мин. в – Графики, отражающие эффективность удлинения праймера в зависимости от времени реакции. Представлены средние значения и стандартные ошибки. г – Соосаждение PrimPol дикого типа и вариантов V546E и D547H с белком RPA. Красной стрелкой обозначено положение полосы субъединицы RPA70, образовавшей комплекс с GST-PrimPol.

Скачать (536KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024