Interaction of fibroblasts with prosthetic materials

Full Text

Организм человека все в большей степени подвергается психологическим и экологическим нагрузкам, способствующим искажению реактивности иммунной и эндокринной систем. На этом фоне материалы имплантатов и зубных протезов могут вызывать нетипичные аллергические и токсико- химические реакции. В связи с этим актуальны сравнительные исследования биосовместимости стоматологических материалов с использованием тонких методов оценки их токсичности в клеточных культурах, в частности фибробластов человека. Материал и методы Из коллекции культур тканей НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского выбраны нормальные клетки фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ-Т). Для культивирования использовали среду Игла (производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова). Для изучения биосовместимости и влияния на ростовую активность клеток ФЭЧ-Т стоматологических материалов применяли метилтетразолиевый тест (МТТ). МТТ - колориметрический тест, который является биологическим стандартом и рекомендован в этом качестве для оценки цитотоксиче- ского действия различных чужеродных веществ на клетки. Тест основан на прямой коррекции количества жизнеспособных клеток и интенсивности метаболизма специального реактива МТТ до водорастворимого темноокрашенного фор- мазана под действием митохондриальной сукцинатдегидро- геназы (мертвые клетки и клетки со сниженной жизнеспособностью такой способностью не обладают). Последующая фотометрия растворенного с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) формазана позволяет точно сопоставить изменение оптической плотности (ОП) раствора по отношению к контролю с изменением количества жизнеспособных клеток, а в цитотоксических исследованиях оценить специфическую гибель клеток, индуцированную тем или иным цитотоксиче- ским агентом. Предварительно отмытые и автоклавирован- ные образцы исследуемых материалов укладывали в лунки 24-луночного планшета Costar (США). Суспензию клеток в посевной дозе 13Т05 кл/мл в среде Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (НПО «ПанЭко», Москва) вносилаи в каждую лунку планшета. Планшеты с образцами и клетками инкубировали в термостате с СО2 при 37°С в течение 48 ч. После инкубации культуральную среду удаляли и проводили МТТ [1-3]. Культуральную среду отсасывали из лунок, добавляли по 1 мл среды с 200 мкл МТТ (3[4,5-диметил-тиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия, «Sigma») в исходной концентрации 5 мг/мл и инкубировали в течение 4 ч. Затем среду с МТТ удаляли и добавляли по 1 мл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Осадок клеток ресуспендировали в течение 5 мин пипетированием. Жизнеспособность клеток оценивали по интенсивности окраски раствора, измеряя ОП при длине волны 545 нм фотометра Immunochem 2100 (США) (см. рисунок). Подсчет выросших клеток, определение их размера и объема в виде гистограммы производили с помощью ручного автоматизированного счетчика клеток пипетки Scepter M^^ore (Германия), которая позволяет получить данные о популяции клеток, концентрации, распределении по размеру и объему. Инкубацию фибробластов выполняли в течение 96 ч. Затем монослой выросших на дне лунок клеток изучали визуально в световом микроскопе Olympus СКХ41 (Япония), снимали смесью 0,02% Версена-Химопсина и разводили в 1 мл среды Игла для подсчета пипеткой Scepter M^^ore. Для изучения морфологии клеток, характера их прикрепления к субстрату прибегали к окрашиванию акридином оранжевым. При взаимодействии с чистыми нуклеиновыми кислотами акридиновый оранжевый образует комплексы, флюоресцирующие зеленым при связывании с ДНК и красным при связывании с РНК. После инкубации в течение 96 ч удаляли культуральную среду, лунки промывали дважды 1 мл фосфатного буфера и добавляли по 1 мл 95% спирта. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Таблица 1. Определение влияния на ростовую активность и жизнеспособность клеток ФЭЧ-образцов с помощью МТТ Образец и его положение ОП 545 нм Разность с контролем, % Титан Grade 4 0,727 ± 0,087 +4,8 Никелид титана 0,657 ± 0,07 -5,1 Титан-ниобий-циркониевый сплав 0,679 ± 0,016 -1,9 Титан-ниобий-танталовый сплав 0,619 ± 0,011 -10,6 Хромокобальтовый сплав 0,767 ± 0,095 + 9,8 Диоксид циркония для каркасов несъемных протезов 0,741 ± 0,047 +6,6 Прессованная керамика 0,620 ± 0,053 -10,4 Диоксид циркония для дентальных имплантатов 0,749 ± 0,09 +7,6 Композит светового отверждения 0,496 ± 0,098 -28,3 Материал для съемных протезов на основе нейлона 0,650 ± 0,027 -6,1 Материал для съемных протезов на основе полиметилметакрилата 0,567 ± 0,061 -18,1 Контроль клеток 0,692 ± 0,071 Через 15 мин удаляли спирт и высушивали лунки. Затем добавляли по 1 мл 0,01% акридинового оранжевого на 10 мин, отмывали дважды 1 мл фосфатного буфера. Покровные стекла с окрашенными клетками вынимали и изучали во флюоресцентном микроскопе Opton Axioskop (Германия). Исследовали следующие материалы известных фирм производителей: Таблица 2. Определение среднего размера и объема клеток с помощью автоматического счетчика клеток Scepter Millipore Показания пипетки Scepter Millipore Образец и его положение средний объем, пл средний диаметр, мкм концентрация, кл/мл соотношение клеток образец/ контроль, % Контроль клеток 3,38 18,63 6,78-104 Титан Grade 4 2,86 17,62 9,21-104 + 135,8 Никелид титана 2,65 17,18 7,64-104 + 112,7 Титан-ниобий- циркониевый сплав 2,44 16,71 9,64Т04 + 142,2 Титан-ниобий- танталовый сплав 1,45 14,06 6,96Т04 + 102,7 Хромокобальтовый сплав 2,46 16,76 4,22Т04 -62,2 Диоксид циркония для каркасов несъемных протезов 2,95 17,80 6,34Т04 -93,5 Прессованная керамика 2,18 16,09 5,99-104 -88,4 Диоксид циркония для дентальных имплантатов 2,7 17,27 6,11104 -90,1 Материал для съемных протезов на основе нейлона 3,02 17,93 5.43-104 -80,1 Материал для съемных протезов на основе полиме- тилметакрилата 2,8 17,52 4,88104 -72,0 - титан Grade 4; - титан-ниобий-циркониевый сплав; - титан-ниобий-танталовый сплав; - никелид титана; - хромокобальтовый сплав; - диоксид циркония для каркасов несъемных протезов; - диоксид циркония для дентальных имплантатов; - прессованную керамику; - композит светового отверждения; - материал для съемных протезов на основе полиметил- метакрилата; - материал для съемных протезов на основе нейлона. Результаты В опытах на биосовместимость установлено, что влияние на ростовую активность ФЭЧ-Т с помощью МТТ все образцы (за исключением композита светового отверждения) через 24 ч инкубации не оказывали токсического влияния на клетки, поскольку показатели не выходили за пределы 20% разницы с показателями контрольного образца (табл. 1). Однако обращает на себя внимание заметная разница с контролем, характерная не только для светоотверждаемого композита (-28,3%), но и для материала для съемных протезов на основе полиметилметакрилата (-18,1%). При изучении морфологии клеток после 96 ч инкубации большинство материалов не угнетало ростовую активность клеток, а сами фибробласты не отличались от контроля. В то же время выявлен процесс дегенерации клеток ФЭЧ, что выражалось в округлении клеток, их укорачивании и откреплении от пластика на дне лунки, в присутствии хромокобальтового сплава, материала для съемных протезов на основе полиметилметакрилата и композита светового отверждения (табл. 2; рис. 2). Так, концентрация клеток в присутствии указанных материалов составляла в сравнении с контрольной соответственно 62,2, 72, 64,3%. После окрашивания клеточной культуры акридиновым оранжевым клетки контроля флюоресцировали в ультрафиолетовом свете желтым цветом, максимально при 550 нм, ядро клеток испускало яркую флюоресценцию, цитоплазма тоже излучала свечение. Клеточная культура в присутствии хромокобальтового сплава, материала для съемных протезов на основе полиметилметакрилата и композита светового отверждения испускали флюоресцентный свет меньшей интенсивности (рис. 3). Заключение Возможности современных методов изучения биосовместимости стоматологических материалов, в частности в клеточной культуре фибробластов человека, позволяют дифференцировать материалы по степени воздействия на клетки. В данном экспериментальном исследовании удалось выявить определенное негативное воздействие на фибробласты человека таких материалов, как хромокобальтовый сплав, материал для съемных протезов на основе полиметилметакрилата и композит светового отверждения.

About the authors

Narine Adolfovna Uzunyan

«Institute for Advanced Studies of FMBA of Russia»

Email: uzunyan.narina@mail.ru
125371, Moscow, Russia

A. A Adamchik

«Institute for Advanced Studies of FMBA of Russia»

125371, Moscow, Russia

D. A Bronshteyn

«Institute for Advanced Studies of FMBA of Russia»

125371, Moscow, Russia

A. Ya Lerner

«Institute for Advanced Studies of FMBA of Russia»

125371, Moscow, Russia

N. O Grishkova

«Institute for Advanced Studies of FMBA of Russia»

125371, Moscow, Russia

A. I Tikhonov

«Institute for Advanced Studies of FMBA of Russia»

125371, Moscow, Russia

Yu. A Povstyanko

«Institute for Advanced Studies of FMBA of Russia»

125371, Moscow, Russia

References

Supplementary files