POSSIBILITIES AND PERSPECTIVES OF RAMAN FLUORESCENCE DIAGNOSTIC APPLICATION IN DENTISTRY

Full Text

Введение В настоящее время в медицине, в том числе в стоматологии, всё большую актуальность приобретают лазерные инновационные, экспрессные медицинские лечебно-диагностические технологии на основе раман- и\или люминесцентных аппаратно-программных комплексов. Зондирующее лазерное излучение (в широком спектральном и энергетическом диапазоне) используют как средство лечения [1-4] и одновременно как средство возбуждения раман-люминесцентных диагностических характеристик [5] исследуемого биологического объекта (этому направлению биофотометрии посвящено предлагаемое исследование). Методика основана на том, что по регистрируемым раман- и/или люминисцентным спектральным (ЛРФД) характеристикам исследуемых объектов (метаболиты микробов, клеток, тканей, биологических жидкостей в норме и при патологии) можно проводить диагностику заболеваний и процессов микробной, метаболической, неопластической и иной природы [6]. В связи с этим цель нашего исследования - экспериментальное обоснование возможности применения лазерных аппаратно-программных комплексов и применение раман-флюоресцентных медицинских технологий в стоматологии. Материал и методы Все исследования и клинические наблюдения выполнены на медицинском аппаратно-программном комплексе «ИнСпектр М» [Патент на полезную модель RU 130700 от 27.07.2013]. С его помощью в течение нескольких секунд производили запись спектрального положения и относительных интенсивностей рамановских и/или люминесцентных линий, своего рода «отпечатков пальцев» исследуемой субстанции, поиск и сравнение их со спектральной базой данных и последующая идентификация исследуемого объекта. Результаты анализа обрабатывали с помощью удобного программного интерфейса и записаны в формате «png». Анализ с образцами микроскопического размера вне полости рта проводили на рамановском микроскопе «ИнСпектр М532» (рис. 1 на вклейке). Для визуального исследования объекта использовался стандартный режим работы микроскопа с использованием окуляров и/или видеокамеры. В его конструкции 30 мВт синий или зелёный одномодовый лазер, обеспечивающий высококачественное спектральное разрешение. При этом в ручном режиме подбирался фокус на определённой точке образца, в которой записывался спектр ЛРФД. С одного объекта снимали 8-10 показателей в разных точках с последующим их усреднением и выводом на один график для анализа. Также применяли ЛРФД непосредственно в полости рта за счёт компактности и портативности модификации прибора «ИнСпектр М», включающей как оптическое волокно, так и различные насадки (рис. 2). Экспериментальные исследования метода фотодинамической терапии (ФДТ) проводили в несколько этапов. 1. Обоснование технологии выбора, регистрации и активации хлорофиллсодержащего препарата (фотостим); 2. Моделирование объёмной ФДТ в пробирке; 3. Исследование накопления хлорофиллсодержащего препарата (фотостим) в тканях и органах; 4. Исследование эффекта воздействия объёмной активированной ФДТ на микробы и опухолевые клетки (культуральный материал) in vitro; 5. Моделирование эффекта объёмной активированной ФДТ на животных (карцинома Эрлиха). Результаты Проведён выбор наиболее информативного АПК для диагностики кариеса (рис. 3-5) и изучены спектры ЛРФД кариеса и степени деминерализации зуба (рис. 6-8). Наиболее информативным и приемлемым для клинического применения оказался АПК ЛКД с длиной волны 405 нм, поэтому последующие исследования твёрдых тканей зуба проводили именно на этой установке. Из представленных данных на рис. 7 и 8 на меловых пятнах зубов (при флюорозе) в спектре рассеянного света видны линии фторапатитов, содержание которых сильно повышено. На здоровых же зубах видны преобладающие линии гидроксиапатитов и кальций апатитов. Проявляются значительные отличия спектров интактных и кариозных тканей зуба. В диапазоне 620-720 нм в спектрах вторых отчётливо видны люминесцентные линии бактериальной микрофлоры (сдвиг спектра вправо), отсутствующие у интактных тканей. Очевидно, что методика является патогенетически обоснованной, так как она в экспресс-режиме способна выявлять такие звенья патогенеза кариеса, как микробный фактор, а также степень деминерализации зуба под действием этого фактора. Данная технология позволяет также объективно и качественно оценивать эффективность механической и медикаментозной обработки полости и канала зуба (рис. 9), состояния гигиены полости рта (рис. 10) с высокой степенью аналитической чувствительности (рис. 11-12 на вклейке, рис. 13), не уступающей бактериологическому методу (104-105 КОЕ/мл). Как видно из рис. 9, интенсивность люминесценции соскоба с языка до его очистки на порядок больше, чем таковая после (даже при разведении соскоба в воде 1 : 6,5). Разницы между образцами возле Impl (дентальный имплантат) до и после чистки (разведение 1 : 14) нет, но их люминесценция в обоих случаях более интенсивная, чем у контрольного образца воды. Индикация лекарственных препаратов и наркотических веществ в концепции применения РФД в стоматологии и других областях медицины заключается не только в большей информативности, удобстве и малогабаритности, но и на основе того, что посредством данной методики можно идентифицировать различные органические (лекарственные препараты, спирты, наркотические вещества) и неорганические вещества, база данных которых позволит исключить приобретение и использование подделок и не сертифицированной продукции. Для этого нет необходимости приобретать отдельный АПК РФД, а только базу данных продукта, который вводится в память используемого для клинических целей компьютера (рис. 14, 15). Определение чувствительности микробов к антимикробным препаратам показало, что после внесения хлорамина спектр синегнойной палочки исчез и спектр раствора хлорамин + бактерия (1:1) стал похож на спектр хлорамина (рис. 16). Это означает, что бактерии под действием данного антисептика инактивированы и разрушены. Это даёт возможность индивидуально подобрать адекватную этиотропную терапию в комплексном лечении пациентов, а в совокупности с отмеченными выше ЛРФД-технологиями оценивать в итоге эффективность лечения. В концепции развития ЛРФД-технологии стало возможным также экспрессно определять тканевую принадлежность, проводить дифференцировку между интактными тканями, доброкачественными и злокачественными опухолями (рис. 17). Обоснован антимикробный и противоопухолевый эффект объёмной активированной фотодинамической терапии заболеваний и процессов микробной и неопластической природы с использованием АПК ЛФД и хлорофиллсодержащего препарата (фотостим), активированного вне организма. На рис. 18, 19 видно, что при использовании активированного фотостима наблюдалось подавление зоны роста микроорганизма через 24 ч. Таким образом, способность фотосенсибилизатора накапливаться в изменённых тканях, микробных клетках с реализацией эффекта летальной фотосенсибилизации бактерий может быть использована, по-видимому, при лечении заболеваний и процессов микробной природы, в том числе при выявлении антибиотикорезистентных штаммов патогенных микроорганизмов. Выявленный эффект существенным образом зависит от концентрации вводимого активированного препарата, длины волны и дозы лазерной его активации (оптимизация эффекта лечения) (рис. 20). Результаты объёмной активированной ФДТ на опухолевых клетках (in vitro) показали (рис. 21), что в контроле клеток происходит активация хемотаксиса в 1,4 раза через сутки после воздействия хемокина. При действии активированного препарата при облучении 100 с миграционная активность опухолевых клеток значительно снижается (в 2,5-4 раза в зависимости от времени) по сравнению с контролями как индуцированного, так и спонтанного хемотаксиса. Таким образом, можно сказать, что ФДТ может снижать миграционную активность опухолевых клеток, что потенциально может быть использовано для блокировки процесса метастазирования у онкологических больных. Апробация методики объёмной активированной ФДТ при лечении опухолей (карцинома Эрлиха у мышей) установила, что мыши в группе с чистым контролем были активны и живы в течение всего исследования (1 год). Мыши со вторым чистым контролем быстро увеличивались в размерах (асцит) и погибали на 4-6-й день. Мыши, получавшие неактивированный хлорофилл, содержащий препарат или раствор 1:10 Н2О2 3% погибали на 6-12-й день. Мыши, получавшие активированный препарат в разведении 1:10, жили 21-24 дня, а при его разведении 1:1000 погибали в пределах 10 дней. Убедительно показан вероятный противоопухолевый эффект хлорофиллсодержащего препарата, активированного вне организма. Таким образом, ЛРФД медицинская технология является уникальным инструментом в арсенале клинициста-стоматолога. Она совмещает экспресс-ность, высокую диагностическую и, главное, аналитическую чувствительность, не уступающую современным методам (бактериологический, гистологический, оптический и др.), с функциями высокотехнологичного лабораторного оборудования. Метод и аппаратура АПК РФД для его реализации, позволяют экспрессно идентифицировать ткани челюстно-лицевой области и вещества органической и неорганической природы непосредственно на рабочем месте врача-стоматолога, расширяя диагностические возможности в отношении заболеваний и процессов микробной природы, неопластических процессов тканей и органов челюстнолицевой области в норме и при патологии. При этом он полностью удовлетворяет потребностям массового стоматологического приёма, позволяя анализировать материал, как непосредственно из полости рта (с помощью оптического волокна), так и вне её на основе фокусировки лазерного луча с помощью микроскопа, совмещённого с лазерным прибором. Представленная медицинская технология требует своего скорейшего внедрения в клиническую практику.

About the authors

M. T Alexandrov

Clinical science center of women health rehabilitation, Institute of Solid State Physics, I.M. Sechenov First MSMU

119991, Moscow, Russia

V. I Kukushkin

Institute of solid state physics, Russian Academy of Sciences

142432, Moscow, Russia

Edita Garnikovna Margaryan

Clinical science center of women health rehabilitation, Institute of Solid State Physics, I.M. Sechenov First MSMU

Email: edita@mail.ru
Cand. med. Sci., assistant of Department of therapeutic stomatology of the I. I. Sechenov First MSMU 119991, Moscow, Russia

E. P Pashkov

Clinical science center of women health rehabilitation, Institute of Solid State Physics, I.M. Sechenov First MSMU

119991, Moscow, Russia

G. E Bagramova

Peoples‘ friendship University of Russia

115093, Moscow, Russia

References

Supplementary files