Expression of CD44, CD29 and osteocalcin differentiation factors in the alveolar bone during past fixation of a free gingival graft

Full Text

Обоснование

Актуальной задачей дентальной имплантологии является выяснение молекулярно-клеточных факторов и механизмов репаративного воздействия на ткани полости рта [1−3].

Формирование десневой манжеты с плотным прикреплением вокруг имплантата в значительной степени определяется объемом костной ткани и регенераторным потенциалом десны и нёба. Поскольку имплантация может проводиться в зоне атрофии твердых и мягких тканей, в большинстве случаев в области установленного имплантата имеется подвижная слизистая оболочка, и костно-пластические манипуляции делают ее еще менее стабильной [4−6]. Подвижная слизистая оболочка менее устойчива к механическим нагрузкам, способствует рецессии мягких тканей в области имплантатов, ускоряет убыль костной ткани [2, 7] и приводит к возникновению периимплантита [8].

«Золотым стандартом» для мягкотканных пластических операций полости рта является использование свободного десневого трансплантата (СДТ) из мягких тканей твердого нёба [9−11]. Однако среди побочных эффектов СДТ отмечается индукция образования альвеолярной кости [12]. До настоящего времени возможность подобных остеогенных модификаций остается дискуссионной. Неизвестно также участие ростовых факторов и трофических молекул в регуляции этих процессов. Динамическое изменение альвеолярной костной ткани зависит от микросреды, которую определяют, прежде всего, васкуляризация и наличие мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [13, 14]. МСК индуцируют пролиферацию и дифференцировку, синтезируя цитокины и факторы роста, и вызывают синергетический ответ соседних клеток [15]. Молекулы межклеточной сигнализации — костные морфогенетические белки (bone morphogenetic proteins, BMP), факторы роста фибробластов (fibroblast growth factor, FGF), транскрипционные факторы MSX 1 и 2 — индуцируют экспрессию генов в МСК и способствуют их детерминации и дифференцировке в остеобласты [16, 17]. Источником МСК и генно-модифицирующих факторов может являться СДТ, соединительная ткань которого богата малодифференцированными клеточными элементами с пролиферативной активностью и остеогенным потенциалом, способными формировать новую кость.

Цель работы — исследовать локализацию стволовых стромальных клеток на поверхности свободного десневого трансплантата.

Материал и методы

В эксперименте воспроизводилась накостная фиксация свободного десневого трансплантата.

Работа выполнена на шести беспородных миниатюрных свиньях-самцах в возрасте 2 лет, весом 30 кг.

Оперативное вмешательство осуществляли в асептических условиях под комбинированным наркозом (пропофол внутривенно, золетил внутримышечно, изофлуран ингаляционно). После обработки операционного поля производили разрез кожи и подкожной клетчатки от подбородка до угла челюсти, затем послойное рассечение тканей до нижнего края нижней челюсти. С наружной стороны челюсти надкостница иссекалась на всю площадь фиксации свободного десневого трансплантата. Свободный десневой трансплантат фиксировался соединительнотканной поверхностью непосредственно на кортикальную пластинку ближе к краю нижней челюсти. Фиксация проводилась костными кнопками (пинами) длиной 3−4 мм. Для контроля положения фиксированного трансплантата на этапе взятия экспериментального материала через 4−6 мес рядом с самим трансплантатном фиксировалась восьмисекционная мини-плата с отверстиями под двухмиллиметровые винты. Рана послойно ушивалась рассасывающимся шовным материалом и обрабатывалась антисептиком. Для визуализации и контроля положения мини-платы (и, соответственно, свободного десневого трансплантата) использовали метод компьютерной томографии с помощью компьютерного томографа GE Optima CT520.

Иммуноцитохимическое исследование. Материал фиксировали в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере в течение 24 ч, после чего промывали 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,2) с 6−7-кратной сменой раствора. Декальцинацию проводили в 25% растворе трилона Б (pH 7,0) при комнатной температуре на аппарате Orbital Shaker OS-20 Biosan. После декальцинации образцы промывали и заливали в парафин по общепринятой методике. Срезы толщиной 15 мкм монтировали на предметные стекла, депарафинировали и инкубировали в 3% растворе перекиси водорода для блокирования эндогенных пероксидаз в течение 15 мин. После трех промывок 0,1 М Na-фосфатном буфером (рН 7,2) срезы обрабатывали в течение 1 ч в 2% растворе бычьего сывороточного альбумина и 0,25% Тритона Х-100. Затем инкубировали с первичными антителами (АТ). Для этой цели использовали мышиные моноклональные АТ против остеокальцина [OCG3] (Abcam, Великобритания) в разведении 10 мг/мл, кроличьи поликлональные АТ против CD44 в разведении 1 : 500 (Abcam, Великобритания) и мышиные моноклональные АТ против CD29 (интегрин-бета-1) (Abcam, Великобритания) в разведении 1 : 100. Первичные АТ разводили в фосфатном буфере, содержащем Тритон Х-100 и бычий сывороточный альбумин, и инкубировали в течение ночи при температуре 4 °С. После промывки срезы в течение 1 ч инкубировали в растворе биотинилированных вторичных антител против иммуноглобулина кролика и мыши соответственно первичным АТ, которые разводили в соответствии с инструкциями фирмы-производителя (Abcam, Великобритания). После отмывки вторичных антител препараты инкубировали в растворе авидин-пероксидазного комплекса (Abcam, Великобритания). Срезы выдерживали в растворе диаминобензидина (DAB Substrate Kit, Abcam, Великобритания) в течение 4 мин, затем промывали, обезвоживали и заключали в бальзам по обычным правилам. В качестве контроля из среды исключали первичные АТ, окрашивание клеток отсутствовало. Часть срезов окрашивали гематоксилином и эозином.

Препараты просматривали в световом микроскопе AxioScope A1 (Carl Zeiss, Германия) и фотографировали при помощи цифровой камеры AxioCam ICc3.

Этическая экспертиза

Условия содержания животных, а также экспериментальные условия соответствовали директиве 2010/63/EU Европейского союза 2010 г., определяющей правила научных экспериментов над животными. Эксперимент одобрен Междисциплинарным комитетом по этике ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России, протокол № 9 от 06.05.2019 г.

Статистический анализ

Морфометрическую обработку полученных фотографий проводили при помощи пакета программ AxioVision 4.8.1. Относительную плотность клеток вычисляли в единице объема (из расчета на 0,01 мм²) костного вещества с учетом поправки на толщину среза и диаметр ядра. Данные обрабатывали методом вариационной статистики с определением t‑критерия достоверности по Стьюденту (р < 0,05).

Результаты

На третьем месяце послеоперационного периода в области контакта альвеолярного отростка и СДТ наблюдается формирование новой компактной кости, имеющей характерные морфологические признаки. К ним относятся параллельно уложенные костные пластинки, формирующие прерывистый поверхностный слой и остеоны различной толщины. На поверхности пластинчатой кости выявляются участки грубоволокнистой ткани с хаотичным сплетением коллагеновых волокон.

При окрашивании гематоксилином и эозином в новообразованной компактной кости на поверхности трансплантата встречаются резко базофильные клетки на фоне оксифильного межклеточного вещества общих пластин. Они имею крупный размер (21 ± 1,8 мкм), овальную или призматическую форму и эксцентричное ядро. По совокупности этих признаков их можно идентифицировать как остеобласты. По ходу пластин остеобласты образуют разновеликие скопления округлой и дугообразной формы или в виде длинных тяжей (рис. 1). Их принадлежность к остеогенному дифферону подтверждается экспрессией остеокальцина, специфического маркера поздней стадии дифференцировки остеобластов.

 

Рис. 1. Новообразованная компактная кость в области контакта СДТ нижней челюсти миниатюрной свиньи. Третий месяц послеоперационного периода. Стрелки указывают на новую кость. Крупные базофильные клетки формируют тяжи вдоль костных пластин (звездочка). Окраска гематоксилином и эозином.

 

На границе расположения новообразованной кости и собственной пластинки десны определяются участки с незамкнутыми костными пластинками в виде округлой, полулунной или разветвленной полости. С их внутренней стороны отмечается скопление стромальных клеток, экспрессирующих CD29 и CD44. Часть этих клеток может выступать за границы лакуны и в виде лентообразных скоплений простираться до остеонов. Также в слое общих пластин мы наблюдали CD44- и остеокальцинпозитивные клетки, имеющие морфологические признаки остеоцитов. Иммунореактивные веретеновидные клетки распределялись неравномерно, формируя отдельные скопления в виде узкой ленты, преимущественно в зоне прободающих коллагеновых волокон со стороны собственной пластинки.

Вся толща костной ткани, находящейся в непосредственной анатомической близости к трансплантату, включает остеоны, вставочные костные пластинки, систему анастомозирующих гаверсовых и фолькмановых каналов с сосудистым компонентом. Среди остеонов можно четко выделить молодые формирующиеся остеоны новой кости и зрелые костные структуры. Диаметр молодых остеонов округлой, овальной или треугольной формы в среднем составляет 225,1 ± 12,3 мкм, количество костных пластин в них варьирует от 3 до 5. Между костными пластинами в лакунах равномерно распределяются остеоциты, клетки веретеновидной формы, с овальным ядром, слабобазофильной цитоплазмой, размером 32,7 ± 2,5 мкм. Каждый остеон окружен хорошо выраженной линией склеивания — базофильным слоем бесклеточного аморфного вещества. Костные пластинки ориентированы циркулярно вокруг центрально расположенного гаверсова канала, средний диаметр его составляет 49,3 ± 4,2 мкм. Полость гаверсова канала выстлана широким слоем тонковолокнистой рыхлой соединительной ткани с клеточными элементами, среди которых наблюдается высокая иммунореактивность CD29, CD44 и остеокальцина (рис. 2, а, б). Такая же высокая экспрессия маркеров отмечается в лакунарных остеоцитах на поверхности костных пластин, непосредственно окружающих канал и прилегающих к собственной пластинке (рис. 2, в). Лакуны преимущественно овальной формы, длиной 36,3 ± 2,8 мкм. В остеонах они ориентированы вдоль костных пластин, тогда как в слое общих и вставочных пластин отмечается хаотичное расположение. Часто обнаруживаются прободающие фолькмановы каналы, анастомозирующие с гаверсовыми, благодаря чему создаются условия для значительного кровоснабжения формирующейся новой кости.

 

Рис. 2. Локализация CD29, CD44 и остеокальцина в костной ткани нижней челюсти беспородной миниатюрной свиньи в области контакта СДТ при накостной фиксации свободного десневого трансплантата. Третий месяц послеоперационного периода.

а — CD29-иммунопозитивные клетки рыхлой волокнистой ткани га- версовых каналов формирующихся остеонов (звездочки); б — CD44-им- мунореактивные клетки остеобластического дифферона (стрелки) между костными пластинками и толстом слое рыхлой соединительной ткани гаверсовых каналов во вновь сформированных остеонах; в — остеокальцин-позитивные остеоциты в слое наружных генеральных пластин, прилегающих к собственной пластинке.

 

Зрелая кость окрашена однородно, слабооксифильно и представлена параллельными общими костными пластинами и зрелыми покоящимися остеонами. Эти остеоны имеют больший диаметр — до 315,2 ± 11,2 мкм, 5–7 параллельных пластин ориентированы также циркулярно, однако узкий гаверсов канал (средний диаметр 21,3 ± 3,1 мкм) часто смещен в сторону. Рыхлая волокнистая соединительная ткань тонким слоем выстилает полость канала; CD29-, CD44и остеокальцинпозитивные клетки здесь практически отсутствуют. Лакуны с остеоцитами имеют вид уплощенного эллипса длиной 43,1 ± 3,3 мкм, располагаются правильными параллельными рядами и в остеонах, и в общих и вставочных пластинах.

Обсуждение

В настоящей работе впервые установлены феномен неоостеогенеза и участие мезенхимальных стволовых клеток в организации этого процесса при установке СДТ. Использованная нами модель СДТ является адекватной при исследовании иммобилизации трансплантата в реципиентной зоне для определения динамики регенераторного процесса на границе тансплантат-ложе. Миниатюрные свиньи часто используются в качестве модели в стоматологических исследованиях из-за схожего с людьми гетеродонтного зубного ряда с резцами и молярами, только немного большего размера [17]. Этапы развития и схожие паттерны прорезывания подтверждают их пригодность в качестве модели животных для стоматологии [18, 19].

Репаративный остеогенез и физиологическая регенерация кости зависят от многих факторов, среди которых преобладающими признаны сосудистое обеспечение, факторы роста и индукция стволовых клеток [20]. Нет сомнения, что они функционируют взаимосвязано и оказывают на растущую кость комплексное воздействие.

Первым ответом ткани реципиента на ткань донора является локальное воспаление в собственной пластинке слизистой оболочки десны. Фибробласты и лейкоциты, поддерживающие это воспаление, активно выделяют факторы, способствующие миграции и пролиферации эндотелия, формированию новой базальной мембраны и росту капилляров [21]. В регуляции ангиогенеза, пролиферации и дифференцировке участвуют фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF), фактор роста фибробластов бета (fibroblast growth factor beta, FGF-β), суперсемейство трансформирующего фактора роста бета (transforming growth factor beta, TGF-β), фактор некроза опухоли альфа (tumor necrosis factor alpha, TNF-α) [8, 22]. Все они являются полифункциональными и, помимо ангиогенеза, формируют соответствующее микроокружение для дифференцировки стромальных стволовых клеток в остеогенные.

Фаза дифференцировки клеток-предшественников в остеобласты происходит на поверхности вновь образованного костного матрикса при регулирующем воздействии факторов роста и костных морфогенетических белков ВМР-2 и ВМР-7 [23, 24].

В наших экспериментах индукция остеогенеза достигается формированием тесных взаимосвязей между тканью трансплантата и тканью альвеолярного отростка. Основными участниками этого процесса являются МСК, которые могут поступать сюда из самого трансплантата либо выселяться из общего кровотока в период постоперационной регенерации нижней или верхней челюсти [25].

Обнаруженные нами маркеры стволовых клеток CD29, CD44 и остеокальцин экспрессируются на разных стадиях дифференцировки остеобластов. CD44 экспрессируются недифференцированными МСК и характеризуют первую стадию регенерации, сопровождающуюся активной пролиферацией клеточных элементов [26]. Детерминированные МСК с остеогенным потенциалом маркируются CD29 (integrin β‑1). Остеокальцин же экспрессируется остеобластами, находящимися на поздней стадии дифференцировки, и характеризует начало формирования новой кости [20, 27]. Кроме того, CD44 и CD29 являются поверхностными рецепторами, посредством которых белки межклеточного матрикса реализуют свои регуляторные эффекты [25, 26].

Клетки, экспрессирующие CD29, CD44 и остеокальцин, обнаруживаются на границе новообразованной кости и собственной пластинки альвеолярного отростка, в зоне общих пластин, на поверхности костных пластин молодых остеонов, окружающих гаверсов канал, и в его полости, находящихся в непосредственной близости к трансплантату. Это позволяет предположить индуцирующую роль в неоостеогенезе СДТ твердого нёба, включающего МСК собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы. Трансплантат выступает как источник трофических и ростовых молекул, формирующих благоприятный метаболический фон для стимуляции пролиферации и дифференцировки МСК реципиента [12, 28]. Сигналы для образования новой кости могут поступать и из ткани нёба. СДТ является источником миграции камбиальных клеток-предшественников остеобластов по крайней мере из двух мест — прогенеторных клеток канала остеона и мягких тканей самого твердого нёба. Нёбо отличается высокой концентрацией стволовых предшественников, что усиливает его остеогенные свойства [29, 30].

В условиях активной клеточной пролиферации стромальных клеток вокруг экзогенных имплантатов и/или трансплантатов происходит формирование новых сосудов, что предполагает существование молекулярных взаимодействий между эндотелием и остеобластическими клетками [20]. Кровеносные сосуды опосредуют миграцию МСК и трофических факторов, поддерживают периваскулярные остеопрогениторные клетки и обеспечивают метаболическую специализированную тканевую среду, необходимую для формирования новой кости.

Заключение

Накостная фиксация СДТ ремоделирует альвеолярную кость, которая проявляет признаки репаративного процесса. Наличие экспрессии CD29 и CD44 в тканях кости указывает на активацию мезенхимальных камбиальных клеток, которые дифференцируются в остеокальцинсодержащие остеобласты. Индуцирующая роль свободного десневого трансплантата в формировании новой кости определяется способностью его клеток синтезировать трофические факторы, стимулирующие рост сосудов пролиферацию и дифференцировку МСК. Модель на миниатюрных свиньях является полезным инструментом для изучения этого процесса.

About the authors

S. S. Edranov

Pacific State Medical University

Email: nymatveeva@mail.ru
Russian Federation, Vladivostok

Natalya Yu. Matveeva

Pacific State Medical University

Author for correspondence.
Email: nymatveeva@mail.ru

Dr. Sci. Med., Head Department of Histology, Cytology and Embryology, Pacific State Medical University

Russian Federation, Vladivostok

S. G. Kalinichenko

Pacific State Medical University

Email: nymatveeva@mail.ru
Russian Federation, Vladivostok

References

Supplementary files