Morphological features of bone regenerate when using bone plastic material based on collagen hydrogel in an experiment

Full Text

Актуальность Ряд острых или хронических патологических процессов может привести к выраженному недостатку объёма костной ткани челюстей. Данное обстоятельство делает невозможным проведение дентальной имплантации с целью восстановления целостности зубного ряда. [1, 2]

Для восстановления утраченного объёма костной ткани или с целью его увеличения были разработаны и широко применяются различные оперативные методики костных пластик, большинство из которых подразумевает использование костнопластического материала. [3]

Несмотря на то, что аутологичные костнопластические материалы (материалы, полученные из организма одного пациента) являются «золотым стандартом» ввиду отсутствия антигенных свойств, они имеют и ряд определенных недостатков. Некоторые авторы обращают особое внимание на высокую скорость резорбции таких материалов в области костной пластики, а также дополнительную травматизацию организма с целью получения трансплантата. [4]

Указанные аспекты послужили толчком для разработки и внедрения костных материалов, имеющих иную природу происхождения и свойства. [5, 6]

Востребованными материалами для костных пластик на сегодняшний день являются ксеногенные трансплантаты - материалы, полученные от представителей другого биологического вида (крупный рогатый скот, свиньи и др.). Данная подгруппа включает в себя костные гранулы и крошку различной дисперсности, костные блоки, изолирующие мембраны и другие формы. Подобные материалы обеспечивают необходимое для костной пластики свойство трансплантата – остеокондукция, то есть способность трансплантата являться структурной основой для адгезии и заселения остеогенными клетками с края дефекта, поддержки их пролиферации и реваскуляризации. [7] Для ксеногенных материалов характерен более продолжительный период резорбции в сравнении с аутологичными трансплантатами. [8]

Одним из основных органических компонентов костного матрикса является коллаген. Коллаген в костной ткани представлен двумя основными типами — в большей мере I и в значительно меньшей III типом. Ксеногенный коллаген в форме сухого вещества зачастую является компонентом различных материалов для костных пластик, где он эффективно реализует указанные свойства. [9, 10]

Соединения коллагена могут быть представлены в форме геля – мягкой, пластичной субстанции. При этом ряд таких материалов способен отверждаться при повышении температуры или при контакте с тканями организма, что представляет интерес с точки зрения свойств остеокондукции. [11]

Несмотря на указанные преимущества, существует лишь несколько зарегистрированных коллагеновых гелей, применяемых с целью костной пластики. При этом клиническая эффективность последних в литературных источниках описана недостаточно или не представлена вовсе.

Таким образом поиск и исследование эффективности отверждаемых коллагеновых гидрогелей в качестве костнопластических материалов является актуальным и востребованным.

 

Цель: Морфологическая оценка остеопластических свойств материала на основе коллагенового гидрогеля в эксперименте.

 

Материалы и методы:

С целью оценки остеопластического потенциала коллагенового гидрогеля было спланировано и проведено экспериментальное исследование на лабораторных животных. Для исследования была выбрана модель критического дефекта свода черепа крысы. [12, 13]

В эксперименте был использован коллагеновый гидрогель отечественного производства «Viscoll» (ООО фирмы ИМТЕК, Россия), а также ксеногенный костный матрикс «Apatos» (Osteobiol, Италия).

Эксперимент был проведен в условиях вивария ГБУЗ МО МОНИКИ. В эксперимент были включены 60 половозрелых самцов белых крыс породы Wistar.

Оперативные вмешательства в условиях операционной проводились под общим обезболиванием Золетил-100.

Описание оперативного вмешательства: после антисептической обработки операционного поля выполнялся линейный разрез кожи в области свода черепа длиной до 2 см, надкостница рассекалась острым путём и отслаивалась. С помощью физиодиспенсера и костного трепана с внешним диаметром 8 мм под постоянным охлаждением был сформирован бикортикальный костный дефект без повреждения мозговых оболочек. Далее, в зависимости от принадлежности к одной из групп, дефект был заполнен одним из костнопластических материалов или оставался незаполненным, после чего производилось послойное ушивание раны с последующей антисептической обработкой.

Животные были поделены на 3 группы:

• Экспериментальная группа: дефект был заполнен материалом, состоящим из смеси коллагенового гидрогеля и ксеногенного костного матрикса.
• Группа сравнения: дефект был заполнен исключительно ксеногенным костным матриксом
• Группа контроля: сформированный дефект оставался незаполненным.

Животные выводились из эксперимента на 30-е, 60-е и 90-е сутки гуманным способом.

Далее было проведено морфологическое исследование образцов экспериментальной группы и группы сравнения: оценивалась целостность ранее произведенного дефекта на различных сроках, размер, наличие дополнительных включений, цвет. После проведенного описания, материал забирался для дальнейшего микроскопического исследования, при этом отдельно исследовались края дефекта и сам дефект.

На первом этапе после проведенной диссекции материал декальцинировали в растворе декальцификата (Лейка Биосистемс), затем фиксировали в 10% забуференном растворе формалина, заливали в парафин по стандартной методике. Серийные парафиновые срезы толщиной 3 мкм депарафинировали по стандартной схеме, после окрашивали гематоксилином и эозином. Для выявления коллагеновых волокон использовали гистохимическую трихромную окраску по Массону.

 

Результаты исследования

Морфологическое описание образцов после 1 месяца.

При макроскопическом исследовании дефектов спустя 1 месяц в образцах экспериментальной группы поверхность ранее произведенного дефекта было гладкой, блестящей. Отмечались очаговые кровоизлияния. В группе сравнения поверхность - шероховатая, с кровоизлияниями. Плотность при диссекции была сопоставима.

При микроскопическом исследовании морфологическая картина образцов обеих групп была практически идентичной. Активное воспаление отсутствовало. В области раннее произведенного дефекта выявлено разрастание фиброзной ткани вокруг гранул ксеногенного костнопластического материала, элементы хронического воспаления, представленные лимфоцитами.

 

Морфологическое описание образцов после 2 месяцев.

Следует отметить, что спустя 2 месяца в образцах экспериментальной группы макроскопически дефект был представлен гладкой блестящей поверхностью, в отличие от группы сравнения, где наблюдались крупнобугристые изменения. Очаги кровоизлияния, дополнительные включения, некроз в обеих группах не определялся. Диссекция производилась с некоторыми усилиями в сравнении с образцами, полученными после первого месяца наблюдения в результате более выраженного обызвествления.

При микроскопическом исследовании в группе сравнения вокруг элементов ксеногенного материала просматривалась выраженная коллагеновая реакция, что подтверждалось при окраске по Массону (Рис 1,2). В обнаруженном стромальном компоненте выявлены в большом количестве разнокалиберные сосуды капиллярного типа. В костных обломках отсутствовали остеоциты и остеобласты.

Рис 1. Коллагенизация стромы. Гематоксилин и эозин. x100

Fig. 1. Collagenization of the stroma. Hematoxylin and eosin. x100

Рис 2. Положительная реакция при окраске по Массону. х100

Fig. 2. Positive reaction during Masson coloring. x 100

 

При микроскопическом исследовании в экспериментальной группе стромальный компонент был более плотным, отмечалось уменьшение сосудистой плотности на мм2. При этом ядра мезенхимальных клеток приобретали более округлую форму, хроматин располагался менее компактно, фигуры митоза не просматривались. Обнаружены немногочисленные остеобласты. Коллагеновый матрикс был частично замещен оссеомукоидом – аморфное бесструктурное вещество (рис.3). Количество элементов ксеногенного материала заметно снижено. Воспалительная инфильтрация отсутствовала. При гистохимической окраске по Массону реакция носила гетерогенный характер, что еще раз подтверждает оссеоидную дифференцировку мезенхимального компонента (рис.4). В одном из участков был обнаружен фокус кальцификации.

Рис 3. Оссеомукоид и частичная его минерализация. Гематоксилин и эозин. x100

Fig. 3. Osseomucoid and its partial mineralization. Hematoxylin and eosin. x100

Рис 4. Гетерогенная экспрессия при окраске по Массону. x100

Fig. 4. Heterogeneous expression during Masson coloring. x100

 

Морфологическое описание образцов после 3 месяцев.

При макроскопическом исследовании спустя 3 месяца в группе сравнения присутствовали образцы с крупнобугристой поверхностью в области дефекта, образцы с гладкой блестящей поверхностью и в части образцов просматривались очаги кровоизлияний (рис.9). 

Напротив, в экспериментальной группе во всех образцах в области дефекта определялась гладкая поверхность. В обеих группах участков некроза, гнойного расплавления не выявлено. Диссекция производилась с трудом в результате отложения солей кальция.

При микроскопическом исследовании в образцах группы сравнения отмечалась организация и упорядоченность стромального компонента. Количество сосудов капиллярного типа заметно уменьшалось. Количество мезенхимальных клеток также сокращалось на мм2 с более разреженным хроматином. Отмечалось большое скопление оссеомукоида с увеличением обызвествленных островков (рис.5). При этом отсутствовали остеоциты и остеокласты. Обнаружены единичные остеобласты (рис.6).

Рис. 5 Появление обызвествленных участков. Гематоксилин и эозин. х100

Fig. 5 The appearance of calcified areas. Hematoxylin and eosin. x 100

Рис. 6 Отсутствие остеоцитов. Гематоксилин и эозин. х100

Fig. 6 Absence of osteocytes. Hematoxylin and eosin. x 100

 

В экспериментальной группе морфологические изменения существенно отличались от контрольной. Так, стромальный компонент был менее выражен, за счет формирования костной пластинки с резким уменьшением количества мезенхимальных клеток и сосудов. В участках остеогенеза обнаружены активные остеобласты, в сформированной костной пластинке просматривались многочисленные лакуны, в части с остеоцитами (рис. 7). На отдельных участках обнаружено врастание кровеносных сосудов в толщу ретикулофиброзной кости. В этой зоне также были обнаружены единичные остеокласты (рис. 8).

 

Рис 7 Активные остеобласты. Гематоксилин и эозин. х400

Fig. 7 Active osteoblasts. Hematoxylin and eosin. x400

Рис 8 Минерализация оссеомукоида. Гематоксилин и эозин. х200

Figure 8 Mineralization of osseomucoid. Hematoxylin and eosin. x200

 

Обсуждение

На сегодняшний день «регенеративная медицина» является одним из ведущих направлений в решении проблем, связанных с болезнями опорно-двигательной системы [14] Костные дефекты часто возникают в результате травм, резекций опухолей, врожденных пороков развития, инфекций, хирургических вмешательств и др., поэтому поиск новых молекул костеобразования является актуальным [15]. В последние годы возрос интерес к использованию биомиметических материалов для инженерии костной ткани. Являясь важным компонентом внеклеточного матрикса костной ткани, коллаген идеален, поскольку он легко разлагается и обладает высокой пластичностью и низкой иммуногенностью [16]. Коллаген оказывает влияние на дифференцировку клеток, принимающих участие в костеобразовании. Так, коллаген стимулирует остеогенную дифференцировку костных мезенхимальных стволовых клеток путём активации двух сигнальных путей, реализуемых с помощью различных протеинкиназ [17] Помимо этого, коллаген может оказывать опосредованное действие на остеокластогенез, что может помочь предотвратить преждевременное рассасывание только что размещенных остеобластоподобных участков [18].

В нашем эксперименте четко прослеживается развитие костной ткани из грубоволокнистой соединительной ткани через формирование остеогенного островка, по аналогии с прямым остеогенезом. При этом следует отметить, что сроки остеогенеза при добавлении гидрогеля намного короче, чем без него, что согласуется с данными литературы. Известно, что чистый коллаген сам по себе не дает удовлетворительных экспериментальных результатов. Поэтому биомиметические коллагеновые каркасы для инженерии костной ткани в виде гидрогеля часто изготавливают вместе с другими биоактивными материалами, среди которых: хитозан, гиалуроновая кислота, альгинат, металлы, гидроксиапатит, биоактивное стекло и др. Такие комбинации позволяют устранить проблему быстрого разрушения коллагена [19]. Таким образом, имеет место подтверждение выдвинутой нами гипотезы: добавление коллагенового гидрогеля в состав костнопластического материала действительно ускоряет процесс костеобразования в области критического дефекта, о чём свидетельствуют морфологические различия образцов экспериментальной группы и группы сравнения после трёх месяцев исследования. Необходимо подчеркнуть, что по данным исследований ряда авторов, использование материалов, содержащих соединения коллагена в сухом виде, было сопоставимо или обеспечивало лучший результат замещения костных дефектов в сравнении с безколлагеновыми аналогами. [20] Такой результат может объясняться тем, что коллаген является основным структурным элементом костного матрикса, а имплантация коллагеновых соединений снижает необходимость его самостоятельного синтезирования.

Важным аспектом настоящего исследования является изучение процесса регенерации костной ткани в динамике, что позволило отметить морфологические различия на разных этапах костеобразования. Данные исследований других авторов, связанных с изучением процессов регенерации костной ткани при применении ксеногенных костнопластических материалов сопоставимы с настоящим исследованием с точки зрения последовательности остеорепарации: после первого месяца исследования в области костного дефекта, при заполнении его ксеногенным костным матриксом наблюдается формирование соединительно-тканных структур, после чего происходит их замещение костной тканью различной степени зрелости через 3 месяца [21].

Форма коллагенового гидрогеля в аспекте костнопластических материалов, ранее также была исследуема в качестве носителя фактора роста rhBMP-2. При этом было доказано, что данный материал обладает высокой биологической совместимостью, а также имеет выраженный остеогенный потенциал, достигнутый благодаря импрегнации rhBMP-2 [22]. В нашем исследовании акцентировано внимание на остеокондуктивных свойствах собственно коллагенового гидрогеля без участия дополнительных агентов. Это позволило еще раз подтвердить высокую биосовместимость материала, доказать его эффективность и определить векторы дальнейшего изучения применения коллагенового гидрогеля с целью костной пластики.

Заключение. При сравнении морфологической картины образцов двух групп можно сделать вывод, что процесс регенерации костной ткани в области сформированного дефекта имеет одинаковый механизм и стадийность. При этом, начиная со второго месяца наблюдения определяются различия гистологической картины, свидетельствующие о более быстром процессе костеобразования в группе, где был применен коллагеновый гидрогель. Таким образом, добавление в состав костнопластического материала коллагенового гидрогеля обеспечивает не только ускорение процесса остеорепарации, но и формирование регенерата, имеющего правильную гистоархитектонику. Вопрос применения коллагенового гидрогеля в качестве компонента костнопластических материалов является перспективным и требует дальнейшего изучения.

 

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ/ADDITIONAL INFO

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

About the authors

Nikita D. Gnatyuk

Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского

Author for correspondence.
Email: nikkitagnatiuk@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5756-4999
SPIN-code: 8391-4718
Russian Federation, Москва

Galia R. Setdikova

Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского

Email: g.setdikova@mknc.ru
ORCID iD: 0000-0002-5262-4953
SPIN-code: 6551-0854
Russian Federation, Москва

Alexander М. Sipkin

Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского

Email: aleksipkin@bk.ru
ORCID iD: 0000-0001-8287-741X
SPIN-code: 3603-1248
Москва

Elizaveta R. Eremeeva

Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского

Email: eremeevaelizaveta@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-0635-8743
SPIN-code: 5775-8648
Москва

References

Supplementary files