Changes in the enamel surface in patients with genetic polymorphism of the VDR gene under the action of remineralizing composition and vitamin D

Full Text

Обоснование

В различных регионах РФ кариес зубов регистрируется у 60—98% взрослого населения [1]. За последние десятилетия, несмотря на современные методы профилактики и диагностики, заболеваемость данной патологией не снижается [2].

Ведущим патогенетическим механизмом в развитии кариеса является нарушение равновесия между процессами де- и реминерализации твердых тканей зуба. Наиболее известным параметром для оценки состояния эмали считается молярное кальциево-фосфатное соотношение (Са/Р), которое является оптимальным при значении 1,67 [3]. В условиях повышенной проницаемости поверхности зуба ионы кальция могут замещаться на близкие по свойству химические элементы, при этом изменяется соотношение Са/Р, что влияет на физико-химические свойства кристаллов [4, 5, 6]. Устойчивость эмали к кислотному растворению и разрушению выше, чем больше коэффициент Ca/P.

Баланс процессов ре- и деминерализации твердых тканей зуба зависит от множества местных и общих факторов. В публикациях ряда авторов установлена связь генетического полиморфизма рецепторов гена (VDR) к витамину D и особенностями минерального обмена [7, 8, 9, 10].

В последние десятилетия определено, что 1,25(OH)₂D₃ (кальцитриол) является медиатором VDR, связывается с ним и обеспечивает контроль минеральной плотности костной ткани. Образуется гормон-рецепторный комплекс D₃-VDR, который активирует синтез кальций-связывающего белка, ускоряет транспортировку Ca²⁺ в цитоплазму клетки, высвобождая его из внутриклеточных депо [11]. Сочетание аллелей VDR влияет на кальциево-фосфатный метаболизм [12]. У 65% популяции людей структура рецептора VDR имеет генетический полиморфизм [13].

Исследование влияния витамина D на структуру и состав твердых тканей зуба у людей с полиморфизмом рецепторов VDR представляет научный и практический интерес.

Цель

Изучить влияние витамина D и пасты с реминерализирующим составом на структурную поверхность эмали у пациентов с генетическим полиморфизмом рецепторов гена VDR.

 

Методы

Дизайн исследования

Исследование относится к экспериментальному многоцентровому проспективному сплошному контролируемому, рандомизированному (Рис. 1).

Критерии соответствия

На стоматологическом приеме обследовано 100 пациентов в возрасте 25-30 лет, у которых провели исследование гена, кодирующего внутриклеточные рецепторы витамина D (VDR).

По результатам генетического тестирования сформировали группу из 18 человек с полиморфизмом гена VDR - А/А (гомозиготное состояние), свидетельствующее о значительном снижении количества рецепторов. Лабораторный показатель 25(ОН) витамина D в крови у данных обследованных находился на уровне 18,2 ± 1,84 нг/мл и расценивался как дефицит (p<0,01).

По ортодонтическим показаниям пациентам с полиморфизмом А/А удаляли ретинированные третьи моляры нижней челюсти. Зубы имели сохраненную анатомическую структуру, без признаков кариозного поражения.

Условия проведения

В 2023 году на базе кафедры стоматологии ФГБУ ДПО «Центральная государственная медицинская академия» прошло исследование, включающее клинический этап и экспериментальный этап в лаборатории Федерального государственного бюджетного научного учреждения Технологический институт сверхтвердых и новых углеродных материалов».

 

 

Описание медицинского вмешательства

По ортодонтическим показаниям 18 пациентам с полиморфизмом гена VDR типом А/А удаляли ретинированные третьи моляры нижней челюсти. Зубы имели сохраненную анатомическую структуру, без признаков кариозного поражения

Основной исход исследования

В ходе экспериментального исследования 18 удаленных зубов опускали в 3 колбы по 6 штук в каждой, со 100 мл искусственной слюны. В состав раствора входили: структурированная вода; электролиты: Na⁺ - 0,3 г/л; К⁺ - 1 г/л; Са²⁺ - 0,05 г/л; Mg²⁺ - 0,01 г/л; Сl^-  - 0,1 г/л; (РO)₄ ^3- - 0,1 г/л; органические вещества: 0,5%-ные карбоксиметилцеллюлоза и альгиновая кислота, мочевина.

Анализ в подгруппах

Перед исследованием емкости с зубами распределили на группы:

первая – содержала раствор только искусственной слюны;

вторая – дополнительно добавили 1000МЕ водного раствора витамина D [14];

третья – эмаль зубов предварительно обрабатывали 2 минуты электрической зубной щеткой с зубной пастой, содержащей реминерализирующий состав, и погружали в искусственную слюну с холекальциферолом 1000МЕ.

Далее колбы с подготовленным материалом устанавливали в лабораторный суховоздушный термостат при температуре 37,4С на сутки. После извлечения из экспериментальных сред образцы промывали проточной водой 30 секунд.

Методы регистрации исходов

В каждой группе у всех образцов проводили электронную микроскопию контактной поверхности эмали на уровне экватора коронки зуба с помощью микроскопа «Tescan Mira LMU» с энергодисперсионным рентгеновским детектором Oxford X-MAX (Рис. 2).

Для изучения морфологии эмали зубы помещали в камеру электронного микроскопа, где создавали условия вакуума <90×10^-3Па, при исследовании поверхности ускоряющее напряжение и токи зонда составляли 1кВ порядка 0,1-1нА соответственно. В режимах топографического (SE) и композиционного (BSE) контрастов сканировали поле 20 мм с различным режимом увеличения в масштабе 100 µм, 20 µм, 5 µм.

Анализ локального минерального состава поверхности эмали проводили с помощью энергодисперсионной спектрометрии (EDS). Исследования осуществляли при токах зонда порядка 20нА и ускоряющем напряжении 13кВ. Оценку атомного и весового % определяли безэталонным методом EDS с помощью программного обеспечения «INCA Point & ID» предварительно проведя количественную оптимизацию по току на кремниевом эталоне при 13кВ.

Этическая экспертиза

Все пациенты, включенные в исследование, перед удалением ретинированных третьих моляров подписывали добровольное согласие на проведение медицинского вмешательства, согласно приказу Минздравсоцразвития РФ №390н от 23.04.2012, в соответствии со статьей 20 Федерального закона №323 от 21.11.2011.

Статистический анализ

Полученные результаты всех проведенных исследований обработаны методами биомедицинской статистики. Средние значения показателей приводятся в виде M±m, где М – среднее, m– ошибка среднего.  Статистически значимыми приняты различия по величине уровня значимости (р), не превышающие 0,05.

Статистическую обработку результатов обследования проводили с использованием Microsoft Excel Office. Сравнение всех исследуемых независимых групп осуществляли с помощью программы SPSS.

 

 

 

 

Результаты

Основные результаты исследования

Во всех образцах зубов первой группы с дефицитом витамина D в плазме крови при электронной микроскопии на изображениях в масштабе 100 µм эмаль представлена регулярной волнистой структурой, образованной перикиматами. Участки с повышенной минерализацией чередовались с зонами пониженной плотности с характерной сотовой структурой. На поверхности эмали определялись разного размера углубления (Рис. 3а).

На электронной картине с масштабом 20 µм визуализировали эмалевые призмы плотно упакованных кристаллов гидроксиапатита в виде гладкой поверхности с участками лакун округлой формы, различных размеров и глубины (Рис. 3б). При изменении масштаба изучаемых участков до 5 µм, в полосах низкой минерализации отчетливо видны межкристаллические поры, образующие межпризменные пространства, заполненные жидкостью (Рис. 3в).

Структурный анализ микроэлементного состава поверхности эмали ретенированных моляров представлены в таблице 1. Коэффициент молярного соотношения Ca/P составил 1,32±0,13 (Таб.1).

Во второй группе образцов зубов с добавлением в раствор искусственной слюны витамина D на электронной микроскопии эмали в масштабе 100 µм сохранялась волнистая структура перикиматов с увеличением их ширины. Поверхность эмали выглядила сглаженной и прослеживается малозаметный «сотовый» рисунок (Рис. 4а).

На сканах в масштабе 20 µм головки эмалевых призм возвышались над поверхностью. Межкристаллическое пространство пор сглажено (Рис. 4б). При максимальном приближении изучаемых участков до 5 µм доказательно визуализировали изменение структуры поверхности эмали, наблюдали уменьшение количества и размеров межкристаллических пор (Рис. 4в).

При мониторинге микроэлементного состава поверхности эмали в присутствии витамина D отмечали возрастание весового процентного состава: Са²⁺; Mg²⁺; Сl^-; (РO)₄^3- (р<0,05). Коэффициент соотношения Ca/P изменился до 1,41±0,02 (Таб. 1).

В третьей группе при наличии холекальциферола и пасты с реминерализирующим комплексом кальция и фосфатов на изображениях в масштабе 100 µм наблюдали изменение структуры эмали. Поверхность приобретала ровный однородный рельеф за счет сглаженности перикиматов (Рис. 5а).

На сканах масштабом 20 µм межкристаллические пространства заполнялись минеральными компонентами (Рис. 5б). При приближении объема изображения до 5 µм головки эмалевых призм возвышались над поверхностью и имели плавный пологий рисунок. Межпризменное пространство закрывалось микроэлементами и визуализировалось в виде неглубоких вдавлений (Рис. 5в).

Анализ микроэлементного состава свидетельствовал об увеличении весового процента микроэлементов (РO)₄^3-и Si⁴⁺ в 2 раза, Са²⁺ в 3 раза и соотношения Са/Р 2,21±0,02 в 1,7 раза (р <0,05). Установлено достоверное снижение в 2 раза весового % Na⁺ по сравнению с первой группой (р <0,05) (Таб.1).

Обсуждение

В первой группе особенности структурного анализа микроэлементного состава поверхности эмали ретенированных моляров у пациентов с полиморфизмом рецептора VDR и дефицитом витамина D в плазме крови обусловлены закономерностями метаболизма в окружающей костной ткани. Известно, что степень минерализации эмали зависит от массовой доли основных микроэлементов таких, как кальций и фосфат. Их весовой процент в образцах зубов 1 группы снижен в сравнении со значениями минералов у пациентов без дефицита витамина D согласно литературным данным [15]. Коэффициент молярного соотношения Ca/P, характеризующий баланс процессов ре- и деминерализации эмали, составил 1,32±0,13, что по мнению [ 3,6.] следует расценивать как деструкцию кристаллов гидроксиапатита.

Во второй группе отмечали насыщение лакун межпризматической жидкостью ионами кальция и фосфата. Транспорт указанных микроэлементов осуществлялся по градиенту концентрации из искусственной слюны в присутствии холекальциферола. Возможно, в присутствии витамина D происходит связывание указанных микроэлементов с фосфатным комплексом, находящимся в указанной среде, с образованием гидроксиаппатитов. Полученный комплекс, по-видимому, частично заполняет межпризменные пустоты. Данные метаболические процессы приводят к незначительному изменению соотношения Ca/P, но не достигает оптимального значения.

В третьей группе дополнительная обработка ретинированных моляров зубной пастой, в присутствии холекальциферола в искусственной слюне привело к насыщению поверхности кальце-фосфатными ионами. Во всех видах изображений эмаль приобретает сглаженный однородный рельеф.

Увеличение весового процента микроэлементов (Са²⁺; (РO)₄^3-; Si⁴⁺) и соотношения Са/Р 2,2±0,02, что свидетельствует об активной фазе реминерализации. Уменьшение весовой доли натрия в структуре эмали объясняется изоморфным замещением ионами Са²⁺, атомный радиус которого больше, что дает конкурентные преимущества в метаболическом обмене и как следствие придает кристаллу гидроксиапатита механическую прочность.

Заключение

У пациентов с полиморфизмом рецептора VDR наблюдается дефицит витамина D в сыворотке крови, что отражается на метаболизме в костной ткани, окружающей ретинированный зуб и структуре поверхности эмали. Микроэлементный состав эмали характеризуется преобладанием фазы деминерализации, лежащей в основе патогенеза кариозного поражения.

Обработка поверхности зуба пастой, содержащей кальце-фосфатные ионы и добавление к искусственной слюне раствора холекальциферола, создают условия для укрепления кристаллической решетки гидроксиаппатитов и повышают кариесрезистентные свойства эмали.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования и подготовке публикации.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведенным исследованием и публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов: Тихонова С.Н.— сбор, анализ литературных источников, проведение экспериментальной части исследования, подготовка и написание текста статьи; Козлова М.В. — идея и дизайн исследования, хирургическое лечение пациентов, участвующих в исследовании, редактирование текста статьи; Горбатова Е.А.— анализ литературных источников, написание и редактирование текста статьи; Евстафьева О.Л. - редактирование текста статьи. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

 

Source of funding. The authors state that there is no external funding when conducting the research and preparing the publication.

Conflict of interest. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest related to the conducted research and the publication of this article.

Author contribution. Tikhonova S.N. — collecting, analyzing literary sources, conducting the experimental part of the study, preparing and writing the text of the article; Kozlova M.V. — the idea and design of the study, surgical treatment of patients participating in the study, editing the text of the article; Gorbatova E.A. — analysis of literary sources, writing and editing the text of the article; Evstafieva O.L. - editing the text of the article. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research and preparation of the article, read and approved the final version before publication).

 

БЛАГОДАРНОСТЬ

Благодарность за проведение генетических тестов ООО «Национальный Центр Генетических исследований» MyGenetics, Россия, г. Новосибирск.

Благодарность за предоставление оборудования и проведение лабораторной части исследования Федеральному государственному бюджетному научному учреждению «Технологический институт сверхтвердых и новых углеродных материалов» Россия, г. Москва

 

Acknowledgments for carrying out genetic tests of LLC "National Center for Genetic Research" MyGenetics, Russia, Novosibirsk.

For providing equipment and conducting the laboratory part of the study to the Federal State Budgetary Scientific Institution "Technological Institute of Superhard and New Carbon Materials" Russia, Moscow.

About the authors

Svetlana N. Tikhonova

Central State Medical Academy at the Department of Presidential Affairs of the Russian Federation, Moscow, Russia

Author for correspondence.
Email: tixonovalana@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-7372-8833
SPIN-code: 6610-7509
Russian Federation, Russia, 121359, Moscow, Marshal Timoshenko str., 19, p. 1A

Marina V. Kozlova

ФГБУ ДПО "ЦГМА" УДП РФ

Email: profkoz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3066-206X
SPIN-code: 5546-2489

заведующий кафедрой стоматологии, Заслуженный врач РФ, профессор, доктор медицинских наук

Russian Federation, Russia, 121359, Moscow, Marshal Timoshenko str., 19, p. 1A

Ekaterina A. Gorbatova

Central State Medical Academy at the Department of Presidential Affairs of the Russian Federation, Moscow, Russia

Email: gorbatova_k@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7729-7979
SPIN-code: 5836-2399

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor of the Department of Dentistry

Russian Federation, Russia, 121359, Moscow, Marshal Timoshenko str., 19, p. 1A

Oksana L. Evstafyeva

Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov, Moscow, Russian Federation

Email: evstafieva_ol@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2358-0557
SPIN-code: 5455-8875

Candidate of Medical Sciences, Associate Professor of the Department of Biochemistry

Russian Federation

References

Supplementary files