Влияние витамина D и реминерализирующей пасты на поверхность эмали у пациентов с полиморфизмом гена VDR

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

В различных регионах РФ кариес зубов регистрируется у 60–98% взрослого населения [1]. За последние десятилетия, несмотря на современные методы профилактики и диагностики, заболеваемость данной патологией не снижается [2].

Ведущим патогенетическим механизмом в развитии кариеса является нарушение равновесия между процессами де- и реминерализации твёрдых тканей зуба. Наиболее известным параметром для оценки состояния эмали считается молярное кальциево-фосфатное соотношение (Са/Р), которое является оптимальным при значении 1,67 [3]. В условиях повышенной проницаемости поверхности зуба ионы кальция могут замещаться на близкие по свойству химические элементы, при этом изменяется соотношение Са/Р, что влияет на физико-химические свойства кристаллов [4–6]. Устойчивость эмали к кислотному растворению и разрушению тем выше, чем больше коэффициент Ca/P.

Баланс процессов ре- и деминерализации твёрдых тканей зуба зависит от множества местных и общих факторов. В публикациях ряда авторов установлена связь полиморфизма рецепторов гена VDR к витамину D и особенностей минерального обмена [7–10].

В последние десятилетия определено, что 1,25(OH)₂D₃ (кальцитриол) является медиатором VDR, связывается с ним и обеспечивает контроль минеральной плотности костной ткани. Образуется гормон-рецепторный комплекс D₃–VDR, который активирует синтез кальций-связывающего белка, ускоряет транспортировку Ca²⁺ в цитоплазму клетки, высвобождая его из внутриклеточных депо [11]. Сочетание аллелей VDR влияет на кальциево-фосфатный метаболизм [10]. У 65% людей структура рецептора VDR имеет генетический полиморфизм [12].

Исследование влияния витамина D на структуру и состав твёрдых тканей зуба у людей с полиморфизмом рецепторов VDR представляет научный и практический интерес.

Цель исследования — изучить влияние витамина D и пасты с реминерализирующим составом на структурную поверхность эмали у пациентов с полиморфизмом рецепторов гена VDR.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Исследование относится к экспериментальному, многоцентровому, проспективному, сплошному контролируемому, рандомизированному (рис. 1).

 

Рис. 1. Дизайн исследования; * в состав раствора входили структурированная вода; электролиты: Na⁺ — 0,3 г/л; К⁺ — 1 г/л; Са²⁺ — 0,05 г/л; Mg²⁺ — 0,01 г/л; Сl^– — 0,1 г/л; (РO)₄^3– — 0,1 г/л; органические вещества: 0,5% карбоксиметилцеллюлозы и альгиновая кислота, мочевина.

Fig. 1. Research design; * the solution contained structured water; electrolytes: Na⁺ — 0.3 g/l; K⁺ — 1 g/l; Ca²⁺ — 0.05 g/l; Mg²⁺ — 0.01 g/l; Сl^– — 0.1 g/l; (PO)₄^3- — 0.1 g/l; organic substances: 0.5% carboxymethylcellulose and alginic acid, urea.

 

Условия проведения

В 2023 году прошло двухэтапное исследование, включающее клиническую часть на базе кафедры стоматологии ФГБУ ДПО «Центральная государственная медицинская академия» и экспериментальную — в лаборатории ФГБНУ «Технологический институт сверхтвёрдых и новых углеродных материалов».

Описание медицинского вмешательства

На стоматологическом приёме обследовано 100 пациентов в возрасте 25–30 лет, считавших себя практически здоровыми, регулярно обращавшихся за оказанием стоматологической помощи (профосмотр и профессиональная гигиена полости рта), проживающих на территории Москвы и Московской области. Всем обследованным проведено исследование гена, кодирующего внутриклеточные рецепторы витамина D (VDR).

По результатам генетического тестирования сформировали группу из 18 человек (6 мужчин и 12 женщин, возраст — 26,0±2,48 года) с полиморфизмом гена VDR А/А (гомозиготное состояние, свидетельствующее о значительном снижении количества рецепторов). Следует отметить, что упрощённый индекс гигиены (ИГР-У) составлял 1,12±0,04, что свидетельствовало о хорошем уровне гигиены полости рта. Показатель КПУ составлял 12,80±0,04, интерпретировался как высокий уровень интенсивности кариеса. Лабораторный показатель 25(ОН) витамина D в плазме крови у данных обследованных находился на уровне 18,20±1,84 нг/мл и расценивался как дефицит холикальциферола.

По ортодонтическим показаниям 18 пациентам с полиморфизмом VDR удаляли ретинированные третьи моляры нижней челюсти. Зубы имели сохранённую анатомическую структуру без признаков кариозного поражения.

В ходе экспериментального исследования 18 удалённых зубов опускали по 6 штук в 3 колбы, в каждой — 100 мл искусственной слюны (в состав раствора входили структурированная вода; электролиты: Na⁺ — 0,3 г/л; К⁺ — 1 г/л; Са²⁺ — 0,05 г/л; Mg²⁺ — 0,01 г/л; Сl^– — 0,1 г/л; (РO)₄^3– — 0,1 г/л; органические вещества: 0,5% карбоксиметилцеллюлозы и альгиновая кислота, мочевина).

Перед исследованием ёмкости с зубами распределили на группы:

• первая содержала раствор только искусственной слюны;
• во вторую дополнительно добавили 1000 МЕ водного раствора витамина D [13];
• в третьей эмаль зубов предварительно обрабатывали в течение 2 мин электрической зубной щёткой с зубной пастой, содержащей реминерализирующий состав, и погружали в искусственную слюну с холекальциферолом 1000 МЕ.

Далее колбы с подготовленным материалом устанавливали в лабораторный суховоздушный термостат при температуре 37,4 °С на сутки. После извлечения из экспериментальных сред образцы промывали проточной водой в течение 30 с.

Методы регистрации исходов

В каждой группе для всех образцов проводили электронную микроскопию контактной поверхности эмали на уровне экватора коронки зуба с помощью микроскопа Tescan Mira 3 LMU (TESCAN, Чехия) с энергодисперсионным рентгеновским детектором X-MAX 5 (Oxford Instruments, Великобритания) (рис. 2).

 

Рис. 2. Микроскоп TESCAN Mira 3 LMU (TESCAN, Чехия).

Fig. 2. TESCAN Mira 3 LMU microscope (TESCAN, Чехия).

 

Для изучения морфологии эмали зубы помещали в камеру электронного микроскопа, где создавали условия вакуума (<90×10^–3 Па). При исследовании зубной поверхности ускоряющее напряжение и токи зонда составляли 1 кВ порядка 0,1–1 нА соответственно. В режимах топографического (SE) и композиционного (BSE) контрастов сканировали поле 20 мм с различным режимом увеличения в масштабе 100, 20, 5 мкм.

Анализ локального минерального состава поверхности эмали проводили с помощью энергодисперсионной спектрометрии (EDS). Исследования осуществляли при токах зонда порядка 20 нА и ускоряющем напряжении 13 кВ. Оценку атомного и весового процента определяли безэталонным методом EDS с помощью программного обеспечения INCA Point & ID, предварительно проведя количественную оптимизацию по току на кремниевом эталоне при 13 кВ.

Этическая экспертиза

Все пациенты, включённые в исследование, перед удалением ретинированных третьих моляров подписывали добровольное согласие на проведение медицинского вмешательства согласно приказу Минздравсоцразвития РФ № 390н от 23.04.2012 и в соответствии со статьёй 20 Федерального закона № 323 от 21.11.2011.

Статистический анализ

Полученные результаты всех проведённых исследований обработаны методами биомедицинской статистики. Средние значения показателей приводятся в виде M±m, где М — среднее, m — ошибка среднего. Статистически значимыми приняты различия по величине уровня значимости (р), не превышающей 0,05.

Статистическую обработку результатов обследования проводили с использованием Microsoft Excel. Сравнение всех исследуемых независимых групп осуществляли с помощью программы SPSS.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Во всех образцах зубов первой группы с дефицитом витамина D в плазме крови при электронной микроскопии на изображениях в масштабе 100 мкм эмаль представлена регулярной волнистой структурой, образованной перикиматами. Участки с повышенной минерализацией чередовались с зонами пониженной плотности с характерной сотовой структурой. На поверхности эмали определялись разного размера углубления (рис. 3, а).

 

Рис. 3. Сканирующая электронная микроскопия эмали опытных образцов зубов пациентов первой группы с дефицитом витамина D и полиморфизмом гена VDR: a — масштаб 100 мкм; b — масштаб 20 мкм; c — масштаб 5 мкм.

Fig. 3. Scanning electron microscopy of enamel of experimental samples of teeth of patients (first group) with vitamin D deficiency and VDR gene polymorphism: a — scale 100 µm; b — scale 20 µm; c — scale 5 µm.

 

На электронной картине с масштабом 20 мкм визуализировались эмалевые призмы плотно упакованных кристаллов гидроксиапатита в виде гладкой поверхности с участками лакун округлой формы, различных размеров и глубины (рис. 3, b). При изменении масштаба изучаемых участков до 5 мкм в полосах низкой минерализации отчётливо видны межкристаллические поры, образующие межпризменные пространства, заполненные жидкостью (рис. 3, с).

Структурный анализ микроэлементного состава поверхности эмали ретенированных моляров представлен в табл. 1. Коэффициент молярного соотношения Ca/P составил 1,32±0,13.

 

Таблица 1. Структурный анализ весового процентного микроэлементного состава поверхности эмали зубов

Table 1. Structural analysis of the weight percentage of trace element composition of the tooth enamel surface

Элемент	Весовой процентный состав микроэлементов, %
	Первая группа (n=6)	Вторая группа (n=6)	p	Третья группа (n=6)	p
Mg2+	0,11±0,02	0,18±0,02	0,035	0,18±0,02	0,035
Na+	0,72±0,05	0,55±0,05	0,039	0,35±0,04	0,002
Si4+	0,24±0,04	0,25±0,03	0,07	0,51±0,05	0,002
P3+	10,65±0,22	14,65±0,72	0,002	18,16±1,96	0,004
Cl–	0,26±0,04	0,37±0,02	0,036	0,48±0,05	0,003
Ca2+	14,05±1,72	20,61±1,38	0,001	39,95±1,98	0,001
Ca/P	1,32±0,13	1,41±0,02	0,512	2,21±0,02	0,003

 

Во образцах зубов второй группы (с добавлением в раствор искусственной слюны витамина D) на электронной микроскопии эмали в масштабе 100 мкм сохранялась волнистая структура перикиматов с увеличением их ширины. Поверхность эмали выглядела достаточно ровной, прослеживался малозаметный «сотовый» рисунок (рис. 4, а).

 

Рис. 4. Сканирующая электронная микроскопия эмали опытных образцов зубов пациентов второй группы с полиморфизмом гена VDR после раствора с витамином D: a — масштаб 100 мкм; b — масштаб 20 мкм; c — масштаб 5 мкм.

Fig. 4. Scanning electron microscopy of enamel of experimental samples of teeth of patients (second group) with VDR gene polymorphism after a solution with vitamin D: a — scale 100 µm; b — scale 20 µm; c — scale 5 µm.

 

На сканах в масштабе 20 мкм головки эмалевых призм возвышались над поверхностью. Межкристаллическое пространство пор было сглажено (рис. 4, b). При максимальном приближении изучаемых участков до 5 мкм доказательно визуализировали изменение структуры поверхности эмали, наблюдали уменьшение количества и размеров межкристаллических пор (рис. 4, с).

При мониторинге микроэлементного состава поверхности эмали в присутствии витамина D отмечали возрастание весового процентного состава: Са²⁺; Mg²⁺; Сl^–; (РO)₄^3– (р <0,05). Коэффициент соотношения Ca/P изменился до 1,41±0,02 (см. табл. 1).

В третьей группе при наличии холекальциферола и пасты с реминерализирующим комплексом кальция и фосфатов на изображениях в масштабе 100 мкм наблюдали изменение структуры эмали. Поверхность приобретала ровный однородный рельеф за счёт сглаженности перикиматов (рис. 5, а).

 

Рис. 5. Сканирующая электронная микроскопия эмали опытных образцов зубов пациентов третьей группы с полиморфизмом гена VDR после раствора с витамином D и реминерализирующей пасты: a — масштаб 100 мкм; b — масштаб 20 мкм; c — масштаб 5 мкм.

Fig. 5. Scanning electron microscopy of enamel of experimental dental samples of patients (third group) with VDR gene polymorphism after vitamin D solution and remineralizing paste: a — scale 100 µm; b — scale 20 µm; c — scale 5 µm.

 

На сканах с масштабом 20 мкм межкристаллические пространства заполнялись минеральными компонентами (рис. 5, b). При приближении объёма изображения до 5 мкм головки эмалевых призм возвышались над поверхностью и имели плавный пологий рисунок. Межпризменное пространство закрывалось микроэлементами и визуализировалось в виде неглубоких вдавлений (рис. 5, c).

Анализ микроэлементного состава свидетельствовал об увеличении весового процента микроэлементов (РO)₄^3– и Si⁴⁺ в 2 раза, Са²⁺ — в 3 раза и соотношения Са/Р 2,21±0,02 — в 1,7 раза (р <0,05). Установлено статистически значимое снижение в 2 раза весового процента Na⁺ по сравнению с первой группой (р <0,05) (см. табл. 1).

ОБСУЖДЕНИЕ

В первой группе особенности структурного анализа микроэлементного состава поверхности эмали ретенированных моляров у пациентов с полиморфизмом рецептора VDR и дефицитом витамина D в плазме крови обусловлены закономерностями метаболизма в окружающей костной ткани. Известно, что степень минерализации эмали зависит от массовой доли основных микроэлементов, таких как кальций и фосфат. Их весовой процент в образцах зубов первой группы снижен в сравнении со значениями минералов у пациентов без дефицита витамина D (согласно литературным данным [14]). Коэффициент молярного соотношения Ca/P, характеризующий баланс процессов ре- и деминерализации эмали, составил 1,32±0,13, что, по мнению авторов работ [3, 6], следует расценивать как деструкцию кристаллов гидроксиапатита.

Во второй группе отмечали насыщение лакун межпризматической жидкости ионами кальция и фосфата. Транспорт указанных микроэлементов осуществлялся по градиенту концентрации из искусственной слюны в присутствии холекальциферола. Возможно, в присутствии витамина D происходит связывание этих микроэлементов с фосфатным комплексом, находящимся в указанной среде, с образованием гидроксиапатитов. Полученный комплекс, по-видимому, частично заполняет межпризменные пустоты. Данные метаболические процессы приводят к незначительному изменению соотношения Ca/P, но оно не достигает оптимального значения.

В третьей группе дополнительная обработка ретинированных моляров зубной пастой и присутствие холекальциферола в искусственной слюне привело к насыщению поверхности кальций-фосфатными ионами. Во всех видах изображений эмаль приобретает сглаженный однородный рельеф.

Увеличение весового процента микроэлементов (Са²⁺; (РO)₄^3–; Si⁴⁺) и соотношения Са/Р (2,20±0,02) свидетельствует об активной фазе реминерализации. Уменьшение весовой доли натрия в структуре эмали объясняется изоморфным замещением ионами Са²⁺, атомный радиус которого больше, что даёт конкурентные преимущества в метаболическом обмене и, как следствие, придаёт кристаллу гидроксиапатита механическую прочность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У пациентов с полиморфизмом рецептора VDR наблюдается дефицит витамина D в сыворотке крови, что отражается на метаболизме в костной ткани, окружающей ретинированный зуб, и на структуре поверхности эмали. Микроэлементный состав эмали характеризуется преобладанием фазы деминерализации, лежащей в основе патогенеза кариозного поражения.

Обработка поверхности зуба пастой, содержащей кальций-фосфатные ионы, и добавление к искусственной слюне раствора холекальциферола создают условия для укрепления кристаллической решётки гидроксиапатитов и повышают кариесрезистентные свойства эмали.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Благодарность. Авторы благодарят за проведение генетических тестов ООО «Национальный центр генетических исследований MyGenetics» (Новосибирск).

Авторы выражают благодарность за предоставление оборудования и проведение лабораторной части исследования ФГБНУ «Технологический институт сверхтвёрдых и новых углеродных материалов» (Москва).

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования и подготовке публикации.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведённым исследованием и публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. С.Н. Тихонова — сбор, анализ литературных источников, проведение экспериментальной части исследования, подготовка и написание текста статьи; М.В. Козлова — идея и дизайн исследования, хирургическое лечение пациентов, участвующих в исследовании, редактирование текста статьи; Е.А. Горбатова — анализ литературных источников, написание и редактирование текста статьи; О.Л. Евстафьева — редактирование текста статьи. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

ADDITIONAL INFORMATION

Acknowledgments. The authors thank LLC National Center for Genetic Research MyGenetics (Novosibirsk) for conducting genetic tests.

The authors express gratitude for the provision of equipment and carrying out the laboratory part of the study at the Technological Institute of Superhard and New Carbon Materials (Moscow).

Funding source. The authors declare that there was no external funding for the research and preparation of the publication.

Competing interests. The authors declare that there are no obvious or potential conflicts of interest related to the research conducted and the publication of this article.

Authors’ contribution. S.N. Tikhonova — collection and analysis of literary sources, conducting the experimental part of the study, preparing and writing the text of the article; M.V. Kozlova — idea and design of the study, surgical treatment of patients participating in the study, editing the text of the article; E.A. Gorbatova — analysis of literary sources, writing and editing the text of the article; O.L. Evstafieva — editing the text of the article. All authors confirm that their authorship meets the international ICMJE criteria (all authors made a significant contribution to the development of the concept, conduct of the study and preparation of the article, read and approved the final version before publication).

Об авторах

Светлана Николаевна Тихонова

Центральная государственная медицинская академия Управления делами Президента

Автор, ответственный за переписку.
Email: tixonovalana@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-7372-8833
SPIN-код: 6610-7509
Россия, Москва

Марина Владленовна Козлова

Центральная государственная медицинская академия Управления делами Президента

Email: profkoz@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3066-206X
SPIN-код: 5546-2489

д-р мед. наук, профессор

Россия, Москва

Екатерина Александровна Горбатова

Центральная государственная медицинская академия Управления делами Президента

Email: gorbatova_k@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7729-7979
SPIN-код: 5836-2399

канд. мед. наук, доцент

Россия, Москва

Оксана Леонидовна Евстафьева

Российский университет медицины

Email: evstafieva_ol@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2358-0557
SPIN-код: 5455-8875

канд. мед. наук, доцент

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы