The use of mixed saliva in the diagnosis of recurrent herpetic stomatitis in dental patients

Full Text

Обоснование

Рецидивирующий герпетический стоматит (РГС) также известный как оральный герпес, является одним из наиболее распространенных вирусных заболеваний в полости рта. Опубликованные данные за 2016 год показала, что около 3,583 миллиарда человек инфицированы оральным герпесом с общей распространенностью 63,6% (95% интервал неопределенности UI: 59,0–66,0) [1]. По данным S Railean et al (2022) рецидивы герпесного стоматита наиболее часто происходят 2 раза в год (79,3%) и более чем в половине случаев приходятся на зимне-весенний период (65,5%) [2].

Для диагностики герпесвирусной инфекции в настоящее время наиболее широко используются: клеточная культура, серологичсеские исследования и полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР-тест является наиболее часто используемым тестом для диагностики простого герпеса [3, 4]. Однако трудоемкость, высокая стоимость реагентов и оборудования для этих тестов создает проблемы при диагностике.

Необходима разработка новых, методов диагностики рецидивирующего герпетического стоматита. Их характеристики должны включать неинвазивность, простоту, использование в режиме реального времени, высокую точность, низкую стоимость анализа, возможность использования на стоматологическом приеме.

В настоящее время смешанная слюна широко используется в инновационных методах диагностики. Биомаркеры смешанной слюны, как индикаторы здоровья и болезни, взывают интерес исследователей, так как в ней содержатся сотни компонентов, которые можно использовать для выявления системных заболеваний или признаков воздействия различных токсичных и мутагенных химических веществ. Использование смешанной слюны для исследований помогает легко, неинвазивно и быстро собирать образцы, тем сам повышая возможности скрининговых исследований [5, 6].

Однако имеются ограниченные данные, подтверждающие диагностическую ценность биомаркеров смешанной слюны при герпесных инфекциях. Показано, что некоторые из этих биомаркеров могут быть подвержены влиянию белков слюны и экспрессироваться в более низких уровнях или совсем не обнаруживаться [7].

Для неинвазивной диагностики рецидивирующиего герпетического стоматита  перспективно применение методов исследования смешанной слюны:  кристаллографии - клиновидная дегидратация [8] и экспресс-метода определения активности амилазы [9].

Метод кристаллографии все чаще используют как тест-систему для экспресс-диагностики соматических заболеваний и общей оценки состояния организма [10]. Основное значение метода кристаллографии заключается в возможности определять патологические изменения на самых ранних этапах. При этом оценивается макроструктура биологической жидкости, формирующаяся при фазовом переходе из жидкого состояния в твердое [11]. В настоящее время наиболее широко микрокристаллизация смешанной слюны изучена при таких стоматологических заболеваниях как кариес (12) и заболевания пародонта [13]. Кристаллографический метод использовался, как вспомогательный в оценке динамики и эффективности лечения пациентов с красным плоским лишаем (14), однако, работ, посвященных его использованию при инфекциях простого герпеса (HSV) в полости рта, нами в доступной литературе не найдено.

Смешанная слюна содержит белок амилазу - гетерогенный кальций-зависимый металлофермент с молекулярной массой 54–62 кДа. Амилаза является пищеварительным ферментом и секретируется поджелудочной железой и слюнными железами. До 70 % амилазы в полость рта секретируют околоушные железы. Секреция амилазы регулируется симпатической нервной системой. Было установлено, что измерение активности амилазы смешанной слюны отражает вызванные стрессом изменения в вегетативной нервной системе и может использоваться для мониторинга активности симпатической нервной системы [15, 16]. В связи с этим, наравне с кортизолом, повышение слюнной α-амилаза широко применяется при диагностике стресса и тревожных расстройств [16, 17, 18, 19, 20]. Установлено повышение α-амилазы смешанной слюны у пациентов с ревматоидным артритом [21], плоскоклеточным раком полости рта или предраковыми поражениями [22, 23], при сахарном диабете [24]. Выявлено повышение α-амилазы слюны у пациентов с пародонтитом [25, 26] и плоским лишаем полости рта [27].

В исследовании М. Honarmand et al. (2020) уровень α-амилазы был достоверно выше в рецидивном периоде губного герпеса по сравнению с периодом выздоровления и контрольной группой.Полученные данные указывает на возможную связь между уровнями α-амилазы в смешанной слюне и губным герпесом [28].

ЦЕЛЬ

Установить информативность использования метода клиновидной дегидратации и экспресс-метода определения активности амилазы смешанной слюны у пациентов с рецидивирующим герпетическим стоматитом.

МЕТОДЫ

Диагностику рецидивирующего герпесного стоматита (РГС) проводили по результатам клинического осмотра и подтверждали с использованием молекулярно-генетических (ПЦР с детекцией в режиме «реального времени») и серологических исследований (ИФА - тест-системы «ВектоВПГ–IgG»).

Пробы смешанной слюны в объеме 1,0 мл собирали у пациентов натощак в микроцентрифужные пробирки Эппендорф 1,5 мл с последующей заморозкой при температуре -20 С.

 При изучении микрокристаллизации смешанной слюны пациентов с РГС мы использовали метод клиновидной дегидратации [8] - способ дегидратации биологической жидкости, размещенной на плоскости. В лаборатории смешанную слюну размораживали и центрифугировали при 3000 оборотов в течение 10 минут. Затем 20 мкл микропипеткой наносили на тест-карту диагностического набора «Литос-система». После завершения дегидратации получалась фация смешанной слюны в виде высушенной пленки. Структурообразующие элементы высушенной капли изучали в прямом свете с помощью медицинского микроскопа МИКМЕД-5 (ЛОМО). Исследованию подвергались натурные образцы высушенных фаций и их фотографии, при разных увеличениях в интервале от х40 до х100 до лечения и через 4 недели после завершения лечения.

Определение активности α-амилазы смешанной слюны проводили с помощью метода, метода Вольгемута, основанного на определении активности остатка крахмала в пробе, усовершенствованного А.П. Годоваловым и соавт. (2019) - микроварианта реакции [29]. Применялся набор реагентов «АМИЛАЗА-ВИТАЛ».

Дизайн исследования

Проведено исследование точности диагностических и прогностических методик у пациентов с РГС. Интервенционное одноцентровое, проспективное, выборочное, неконтролируемое исследование.

Исследование выполнено в соответствии с этическими принципами Хельсинской декларации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» (г. Форталеза, 2013), ГОСТ Р 52379-2005 «Надлежащая клиническая практика», «Правила клинической практики в Российской Федерации», утвержденные Приказом Минздрава РФ от 01.04.2016 г. №200н. Все обследованные подписали информированное согласие на публикацию данных, полученных в результате исследований, без идентификации личности.

Критерии соответствия

Критерии включения в исследование пациентов: возраст старше 18 лет; обострение экстраорального и внутриротового герпеса в настоящий момент; имеющие эпизоды обострения экстраорального и внутриротового герпеса в анамнезе 4 раза в год и более; подписание информированного согласия на публикацию данных, полученных в результате исследований, без идентификации личности;

Критерии исключения из исследования: сопутствующая декомпенсированная общесоматическая патология; прием наркотических и психотропных препаратов; отказ от лечения.

Условия проведения

Исследование было выполнено в НИИ Стоматологии и ЧЛХ ПСПбГМУ имени академика И.П. Павлова, на кафедре внутренних болезней стоматологического факультета, в стоматологической клинике «Ренессанс Дент», на базе кафедры пропедевтики стоматологических заболеваний и медицинского центра А.Н. Соколова.

Продолжительность исследования

Осмотры и обследования пациентов после завершения лечения осуществляли четыре раза: сразу по завершении лечебного курса; через 2 недели; через 4 недели; через 6 месяцев.

Описание медицинского вмешательства

Лечение пациентов с РГС проводилось с использованием препаратов рекомбинантных интерферонов. Интерферон гамма человеческий рекомбинантный – ингарон подкожно. Дозировка - 1 раз в сутки подкожно 500 000 МЕ, через день. Курс лечения составляет 5 инъекций. Для общеукрепляющего лечения назначали витамины группы В и С, так как они показаны не только для компенсации дефицита витаминов в организме, но и активно влияют на различные функции, воздействуя на обмен веществ и нервно-рефлекторную регуляцию, дают положительный эффект при различных соматических заболеваниях (имеющиеся у больных РГС). Местное лечение РГС заключалось в проведении местной противовирусной и противовоспалительной терапии: полоскание полости рта антисептическими (0,2% раствором хлоргексидина) и обезболивающими средствами (Тантум-Верде); аппликации противовирусными препаратами (зовиракс) назначали в первые часы развития заболевания (максимум до 72 часов), а также аппликации препаратами, стимулирующих быстрое заживление слизистой оболочки (кератопластическая терапия) - масляный раствор витамина А, каротолин или солкосерил дентальная адгезивная паста.

Основной исход исследования

Показана информативность использования метода клиновидной дегидратации смешанной слюны и определения активности альфа-амилазы смешанной слюны в динамике лечения пациентов с РГС.

Анализ в подгруппах

В исследование были включены 26 пациентов с РГС в стадии обострения (19 женщин и 7 мужчин, средний возраст 41,7± 3,5 лет), частота обострений 4 и более в год и 14 пациентов контрольной группы без РГС (10 женщин, 4 мужчин, средний возраст 39,8± 3,9 лет).

Статистический анализ

Обработку данных проводили на персональном компьютере PC Pentium IV с помощью компьютерных программ Statistica 6.0 и Excel 2003.  Для сравнения независимых групп при нормальном распределении признака применяли критерий Стьюдента (t). Статистически значимыми считали различия при р≤0,05 (вероятность различий больше 95%).

Результаты и обсуждение

При клиническом осмотре пациентов выявлялся отек и покраснение слизистой полости рта. Герпетические элементы (болезненные язвы) в основном локализовались в области языка, десны и дна полости рта (периоральный герпес). В ряде случаев также отмечалось поражение губ (лабиальный герпес) (рис. 1).

Рис. 1

Для подтверждения диагноза проведено ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» и определение Ig G к HSV-1 (табл. 1).

Табл. 1

Результаты кристаллографии показали, что для фаций ротовой жидкости у пациентов с рецидивирующим герпетическим стоматитом в стадии обострения в белковой зоне характерны укороченные радиальные линии (УРЛ) (рис. 2).

Рис. 2

Таким образом, косвенные признаки увеличения колоний персистирующих вирусов герпеса сопровождаются нарушением состояния смешанной слюны с формированием специфически измененных фаций при клиновидной дегидратации, обнаружение которых может служить фактором верификации герпесвирусного носительства.

После завершения лечения, укороченные радиальные линии в периферической (белковой) зоне исчезли, и на периферии центральной зоны фаций слюны появился набор различных линий (прямые, горизонтальные, дисковые, разветвленные трещины), которые начинались в краевой зоне,  что может быть свидетельством хронизации инфекции (рис. 3, табл.2).

Рис. 3

Как показано в табл. 2, у пациентов с РГС наиболее часто выявлялись разветвленные трещины с 3 узлами, далее следовали разветвленные с 2 узлами и дисковые.

Табл. 2

При воспалительном процессе можно ожидать изменение синтеза и активности амилазы смешанной слюны. У пациентов с РГС в период обострения было установлено повышение активности амилазы смешанной слюны (табл. 3).

Табл. 3

В течение месяца активность амилазы не снизилась. Изменение активности амилазы не коррелировало с частотой рецидивов простого герпеса в год, а определялось тяжестью заболевания и индивидуальными особенностями организма. Полная реабилитация наступала в течение двух месяцев с начала заболевания и зависела от процессов восстановления организма после интоксикации и от возможности перехода заболевания в хроническую форму. Переход в хроническую форму приводил к уменьшению активности амилазы и увеличению времени ремиссии.

Заключение

Косвенные признаки увеличения колоний персистирующих вирусов герпеса сопровождаются нарушением состояния смешанной слюны с формированием специфически измененных фаций при клиновидной дегидратации, обнаружение которых может служить фактором верификации герпесвирусного носительства. Этот метод диагностики является неинвазивными, информативными, а значит, может применяться для обоснования терапии и выбора времени стоматологической санации.

У пациентов с РГС в период обострения было установлено повышение активности амилазы смешанной слюны. Время восстановления активности амилазы до межрецидивного уровня имело свои особенности и зависело от тяжести течения заболевания. В среднем по группе пациентов снижение повышенной активности амилазы наступало в сроки до двух месяцев.

Для подтверждения диагноза рецидивирующий герпетический стоматит рекомендован неинвазивный метод клиновидной дегидратации по образцам ротовой жидкости, а для определения эффективности лечения, наряду с клиническими показателями, наиболее информативен тест, основанный на исследовании уровня амилазы в смешанной слюне.

About the authors

Vera Osipova

Author for correspondence.
Email: veraosipova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1989-5460
SPIN-code: 3133-9430

Vladimir Grishin

Email: wgrishin54@mail.ru
ORCID iD: 0009-0009-6231-4914
SPIN-code: 6076-2783

Lyudmila Vladimirova

Email: vlg9@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7213-9701
SPIN-code: 5847-4495

Vladislav Ivanovsky

Email: ivanovskiy.1995@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-2477-3676
SPIN-code: 7935-6019

References

Supplementary files