Использование смешанной слюны в диагностике рецидивирующего герпетического стоматита у стоматологических пациентов: интервенционное одноцентровое, проспективное, выборочное, неконтролируемое исследование

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Рецидивирующий герпетический стоматит (РГС), также известный как оральный герпес, является одним из наиболее распространённых вирусных заболеваний в полости рта. Опубликованные данные за 2016 год демонстрируют, что около 3,6 миллиарда человек инфицированы оральным герпесом с общей распространенностью 63,6% (95% интервал неопределенности, UI: 59,0–66,0) [1]. По данным Railean S. и соавт. (2022), РГС, как правило, происходит 2 раза в год (79,3%) и более чем в половине случаев приходится на зимне-весенний период (65,5%) [2].

Для диагностики герпес-вирусной инфекции в настоящее время наиболее широко используются клеточные культуры, серологичсеские исследования и полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР-тест является наиболее часто используемым тестом для диагностики простого герпеса [3, 4]. Однако трудоёмкость, высокая стоимость реагентов и оборудования для этих тестов создаёт проблемы при диагностике.

Необходима разработка новых методов диагностики РГС. Их характеристики должны включать неинвазивность, простоту, использование в режиме реального времени, высокую точность, низкую стоимость анализа, возможность использования на стоматологическом приёме.

В настоящее время смешанная слюна широко используется в инновационных методах диагностики. Биомаркёры смешанной слюны, как индикаторы здоровья и болезни, вызывают интерес исследователей, так как в ней содержатся сотни компонентов, которые можно использовать для выявления системных заболеваний или признаков воздействия различных токсичных и мутагенных химических веществ. Использование смешанной слюны для исследований помогает легко, неинвазивно и быстро собирать образцы, тем самым повышая возможности скрининговых исследований [5, 6].

Однако имеются ограниченные данные, подтверждающие диагностическую ценность биомаркёров смешанной слюны при герпесных инфекциях. Показано, что некоторые из этих биомаркёров могут быть подвержены влиянию белков слюны и экспрессироваться в более низких концентрациях или совсем не обнаруживаться [7].

Для неинвазивной диагностики рецидивирующиего герпетического стоматита перспективно применение методов исследования смешанной слюны: кристаллографии (клиновидная дегидратация [8]) и экспресс-метода определения активности α-амилазы [9].

Метод кристаллографии все чаще используют как тест-систему для экспресс-диагностики соматических заболеваний и общей оценки состояния организма [10]. Основное значение метода кристаллографии заключается в возможности определять патологические изменения на самых ранних этапах. При этом оценивается макроструктура биологической жидкости, формирующаяся при фазовом переходе из жидкого состояния в твёрдое [11]. В настоящее время наиболее широко микрокристаллизация смешанной слюны распространена при таких стоматологических заболеваниях, как кариес [12] и заболевания пародонта [13]. Кристаллографический метод используется как вспомогательный в оценке динамики и эффективности лечения пациентов с красным плоским лишаем [14]. Однако работы, посвященные его использованию при инфекциях простого герпеса (HSV) в полости рта, в доступной литературе не найдены.

Смешанная слюна содержит белок α-амилазу — гетерогенный кальций-зависимый металлофермент с молекулярной массой 54–62 кДа. Амилаза является пищеварительным ферментом и секретируется поджелудочной железой и слюнными железами. До 70% α-амилазы в полости рта секретируются околоушными железами. Секреция α-амилазы регулируется симпатической нервной системой. Было установлено, что измерение активности амилазы смешанной слюны отражает вызванные стрессом изменения в вегетативной нервной системе (НС) и может использоваться для мониторинга активности симпатической НС [15, 16]. В связи с этим, наравне с кортизолом, повышение слюнной α-амилаза широко применяется при диагностике стресса и тревожных расстройств [16–20]. Установлено повышение α-амилазы смешанной слюны у пациентов с ревматоидным артритом [21], плоскоклеточным раком полости рта или предраковыми поражениями [22, 23], при сахарном диабете [24]. Выявлено повышение α-амилазы слюны у пациентов с пародонтитом [25, 26] и плоским лишаем полости рта [27].

В исследовании Honarmand М. и соавт. (2020) уровень α-амилазы был достоверно выше в период рецидива губного герпеса по сравнению с периодом выздоровления и контрольной группой. Полученные данные указывают на возможную связь между уровнями α-амилазы в смешанной слюне и губным герпесом [28].

Цель исследования — установить информативность использования метода клиновидной дегидратации и экспресс-метода определения активности α-амилазы смешанной слюны у пациентов с РГС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Диагностику РГС проводили по результатам клинического осмотра и с помощью молекулярно-генетических (ПЦР с детекцией в режиме «реального времени») и серологических исследований (ИФА — тест-системы «ВектоВПГ–IgG» (Вектор-Бест, Россия).

Пробы смешанной слюны в объеме 1,0 мл собирали у пациентов натощак в микроцентрифужные пробирки Эппендорф объёмом 1,5 мл с последующей заморозкой при температуре –20 ℃.

При изучении микрокристаллизации смешанной слюны у пациентов с РГС мы использовали метод клиновидной дегидратации — способ дегидратации биологической жидкости, размещенной на плоскости [8]. В лаборатории смешанную слюну размораживали и центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 мин. Затем 20 мкл микропипеткой наносили на тест-карту диагностического набора «Литос-система» (ФГУ Российский научно-исследовательский институт геронтологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, Москва, Россия). После завершения дегидратации получалась фация смешанной слюны в виде высушенной пленки. Структурообразующие элементы высушенной пленк изучали в прямом свете с помощью медицинского микроскопа МИКМЕД-5 (ЛОМО, Россия). Исследованию подвергали натурные образцы высушенных фаций и их фотографии при разных увеличениях в интервале от ×40 до ×100 до лечения и через 4 недели после его завершения.

Определение активности α-амилазы смешанной слюны проводили с помощью метода Вольгемута, основанного на определении активности остатков крахмала в пробе, усовершенствованного Годоваловым А.П. и соавт. в 2019 году [29]. Применялся набор реагентов «АМИЛАЗА-ВИТАЛ».

Дизайн исследования

Проведено исследование точности диагностических и прогностических методик у пациентов с РГС: интервенционное одноцентровое, проспективное, выборочное, неконтролируемое исследование.

Исследование выполнено в соответствии с этическими принципами Хельсинской декларации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» (г. Форталеза, 2013), ГОСТ Р 52379-2005 «Надлежащая клиническая практика», «Правила клинической практики в Российской Федерации», утвержденные Приказом Минздрава РФ от 01.04.2016 г. № 200н. Все обследованные подписали информированное согласие на публикацию данных, полученных в результате исследований, без идентификации личности.

Критерии соответствия

Критерии включения в исследование пациентов:

• возраст старше 18 лет;
• обострение экстраорального и внутриротового герпеса в настоящий момент;
• имеющиеся эпизоды обострения экстраорального и внутриротового герпеса в анамнезе 4 раза в год и более;
• наличие подписанного информированного согласия на публикацию данных, полученных в результате исследований, без идентификации личности.

Критерии невключения:

• сопутствующая декомпенсированная общесоматическая патология;
• приём наркотических и психотропных препаратов;
• отказ от лечения.

Условия проведения

Исследование было выполнено в НИИ стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова (Санкт-Петербург), на кафедре внутренних болезней стоматологического факультета; в стоматологической клинике «Ренессанс Дент» (Санкт-Петербург), на базе кафедры пропедевтики стоматологических заболеваний и медицинского центра А.Н. Соколова (Санкт-Петербург).

Продолжительность исследования

Осмотры и обследование пациентов после завершения лечения осуществляли четыре раза: сразу по завершении лечебного курса; через 2 недели; через 4 недели; через 6 месяцев.

Описание медицинского вмешательства

Лечение пациентов с РГС проводилось с использованием препаратов рекомбинантных интерферонов. Интерферон гамма человеческий рекомбинантный в дозе 500 000 МЕ 1 р/сут подкожно, через день. Курс лечения — 5 инъекций. Для общеукрепляющего лечения назначали витамины группы В и С, помимо своего основного назначения, они активно влияют на различные функции, воздействуя на обмен веществ и нервно-рефлекторную регуляцию, дают положительный эффект при различных соматических заболеваниях (имеющиеся у больных РГС). Местное лечение РГС заключалось в проведении противовирусной и противовоспалительной терапии: полоскание полости рта антисептическими (0,2% раствором хлоргексидина) и обезболивающими средствами (спрей бензидамина гидрохлорида 0,255 мг); аппликации противовирусными препаратами (ацикловир) назначали в первые часы развития заболевания (максимум до 72 ч), а также аппликации препаратами, стимулирующими быстрое заживление слизистой оболочки (кератопластическая терапия) — масляный раствор витамина А, бетакаротен или дентальная адгезивная паста.

Основной исход исследования

Определение активности α-амилазы смешанной слюны в динамике лечения пациентов с РГС с использованием метода клиновидной дегидратации смешанной слюны.

Анализ в подгруппах

В исследование были включены 26 пациентов с РГС в стадии обострения (19 женщин и 7 мужчин, средний возраст — 41,7±3,5 лет), частота обострений — 4 и более в год. Контрольную группу составили 14 пациентов без РГС (10 женщин и 4 мужчины, средний возраст — 39,8±3,9 лет).

Статистический анализ

Обработку данных проводили на персональном компьютере PC Pentium IV с помощью компьютерных программ «STATISTICA 6.0» (StatSoft Inc., США) и «MS Excel 2003» (Microsoft, США). Для сравнения независимых групп при нормальном распределении признака применяли t–критерий Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при р ≤0,05 (доверительный интервал — 95%).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При клиническом осмотре пациентов определялся отёк и покраснение слизистой полости рта. Герпетические элементы (болезненные язвы) в основном были локализованы в области языка, десны и дна полости рта (периоральный герпес). В ряде случаев также отмечалось поражение губ (лабиальный герпес; рис. 1).

 

Рис.1. Клиническая картина рецидивирующего герпетического стоматита: a — красная кайма губ, b — слизистая щек, c — десна и альвеолярный гребень, d — дно полости рта.

Fig. 1. Clinical picture of recurrent herpetic stomatitis: a — red border of the lips, b — buccal mucosa, c — gums and alveolar ridge, d — floor of the mouth.

 

Для подтверждения диагноза проведено ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» и определение Ig G к HSV-1 (табл. 1).

 

Таблица 1. Концентрации HSV-1 и Ig G к HSV-1 у пациентов основной и контрольной группы

Table 1. Concentrations of HSV-1 and Ig G to HSV-1 in patients of the main and control groups

Группы пациентов	Концентрация HSV-1 (Aбс./COV) <1,000*	Антитела (Ig G) к HSV-1 (Е/мл) <1*
Основная (n=26)	14,1±1,8	109,2±18,6
Контрольная (n=14)	0,33±0,07	1,99±0,22

* референсные значения.

* reference values.

 

Результаты кристаллографии показали, что для фаций ротовой жидкости у пациентов с РГС в стадии обострения в белковой зоне характерны укороченные радиальные линии (УРЛ; рис. 2).

 

Рис.2. Изображения белковой зоны фаций ротовой жидкости при клиновидной дегидратации у пациентов с рецидивирующим герпетическим стоматитом в период обострения: a — контрольная группа, b — пациенты в стадии обострения.

Fig. 2. Images of the protein zone of oral fluid facies during wedge-shaped dehydration in patients with recurrent herpetic stomatitis during an exacerbation: a — control group, b — patients in the acute stage.

 

Таким образом, косвенные признаки увеличения колоний персистирующих вирусов герпеса сопровождаются нарушением состояния смешанной слюны с формированием специфически изменённых фаций при клиновидной дегидратации, обнаружение которых может служить фактором верификации герпес-вирусного носительства.

После завершения лечения, укороченные радиальные линии в (белковой) зоне исчезли, и на периферии центральной зоны фаций слюны появился набор различных линий (прямые, горизонтальные, дисковые, разветвленные трещины), которые начинались в краевой зоне, что может быть свидетельством хронизации инфекции (рис. 3, табл. 2).

 

Таблица2. Маркёры патологии в периферической зоне фаций ротовой жидкости при ее клиновидной дегидратации после завершения лечения

Table 2. Markers of pathology in the peripheral zone of oral fluid facies during its wedge-shaped dehydration after completion of treatment

РГС, n=26	Всего	Прямые	Трещины разветвлённые			Горизонтальные	Дисковые
			1 узел	2 узла	3 узла
После лечения	131±6,9	9,6±1,33	18,0±1,6	30,4±1,0	44±3,9	3,8±0,7	25±4,8

Примечание. РГС — рецидивирующий герпесный стоматит.

Note. РГС — recurrent herpes stomatitis.

 

Рис.3. Изображения фаций ротовой жидкости при ее клиновидной дегидратации после завершения лечения у пациентов (межрецидивный период): a — до лечения, b — после лечения.

Fig. 3. Images of oral fluid facies during wedge-shaped dehydration after completion of treatment in patients (inter-relapse period): a — before treatment, b — after treatment.

 

Как показано в таблице 2, у пациентов с РГС наиболее часто выявлялись разветвлённые трещины с 3 узлами, далее следовали разветвлённые с 2 узлами и дисковые.

При воспалительном процессе можно ожидать изменение синтеза и активности α-амилазы смешанной слюны. У пациентов с РГС в период обострения было установлено повышение ее активности (табл. 3).

 

Таблица 3. Активность α-амилазы до и после лечения у пациентов

Table 3. α-Amylase activity before and after treatment in patients

Группы	Активность амилазы Ед/мл (норма 160–640 Ед/мл)
	До лечения		После лечения
	ремиссия	обострение	2 недели	1 мес	1,5 мес	2 мес
Основная (РГС), n=26	570±12,8*	1156±11,3*	1110±22,4*	808±24,3*	625±17,4*	592±13,2*
Контрольная, n=14	418±21,9

* различия относительно контрольной группы статистически значимы при р ≤0,001.

* differences are statistically significant in р ≤0,001.

 

В течение месяца активность α-амилазы не снизилась. Изменение её активности не коррелировало с частотой рецидивов простого герпеса в год, а определялось тяжестью заболевания и индивидуальными особенностями организма. Полная реабилитация наступала в течение 2-х мес. с начала заболевания и зависела от процессов восстановления организма после интоксикации и от возможности перехода заболевания в хроническую форму. Переход в хроническую форму приводил к уменьшению активности α-амилазы и увеличению времени ремиссии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Косвенные признаки увеличения колоний персистирующих вирусов герпеса сопровождаются нарушением состояния смешанной слюны с формированием специфически измененных фаций при клиновидной дегидратации, обнаружение которых может служить фактором верификации герпес-вирусного носительства. Этот метод диагностики является неинвазивными, информативными, а значит, может применяться для обоснования терапии и выбора времени стоматологической санации.

У пациентов с РГС в период обострения было установлено повышение активности α-амилазы смешанной слюны. Время же восстановления её активности до межрецидивного уровня имело свои особенности и зависело от тяжести течения заболевания. В среднем снижение активности α-амилазы наступало в течение 2-х мес.

Для подтверждения диагноза РГС рекомендован неинвазивный метод клиновидной дегидратации по образцам ротовой жидкости, а для определения эффективности лечения, наряду с клиническими показателями, наиболее информативен тест, основанный на исследовании уровня α-амилазы в смешанной слюне.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования и подготовке публикации.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с проведенным исследованием и публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. В.А. Осипова — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников; В.В. Гришин — обработка и анализ полученных данных; Л.Г. Владимирова — исследование кристаллизации слюны методом клиновидной дегидратации; В.А. Ивановский — лечение пациентов, определение активности амилазы слюны.

Об авторах

Вера Анатольевна Осипова

Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Email: veraosipova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1989-5460
SPIN-код: 3133-9430

канд. мед. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург

Владимир Васильевич Гришин

Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова; Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: wgrishin54@mail.ru
ORCID iD: 0009-0009-6231-4914
SPIN-код: 6076-2793

канд. хим. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Людмила Георгиевна Владимирова

Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Email: vlg9@mail.ru
SPIN-код: 5847-4495

канд. хим. наук

Россия, Санкт-Петербург

Владислав Андреевич Ивановский

Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Email: ivanovskiy.1995@bk.ru
ORCID iD: 0000-0003-2477-3676
SPIN-код: 7935-6019
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы