Effect of citric acid concentration and etching duration on the surface roughness of prepared human tooth enamel: an in vitro study

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Зубы подвергаются воздействию различных кислот во время ежедневного функционирования. Очень распространённым источником воздействия является лимонная кислота (при употреблении фруктов или соков). Несмотря на исключительные прочностные свойства человеческой эмали, покрывающей нижележащий дентин в области коронки зуба, кислые пищевые продукты и напитки способствуют её растворению [1–3]. Это может привести к потере значительной поверхности зуба. С другой стороны, в клинической практике широко используется кислотно-локализованное травление для увеличения сцепления реставрационных материалов с поверхностью зуба. Оно обеспечивает частичное растворение и деминерализацию неорганического матрикса поверхности эмали, в результате чего формируются микропористости и микропазы [4–8]. Этот процесс приводит к увеличению шероховатости поверхности эмали. Предварительное травление эмали способно улучшить значения прочности сцепления систем связывания на основе смолы с эмалью по сравнению с использованием тех же систем без предварительного травления [9, 10]. Для этих целей могут быть использованы различные кислоты [11–13]. Ортодонты также используют кислоту для формирования удерживающих поверхностей, что, с одной стороны, улучшает фиксацию брекета, но, с другой стороны, ослабляет структуру смежных эмалевых призм, повышает проницаемость и адгезию биоплёнки к эмали и снижает её защитные свойства [14].

В научных целях разумное применение кислотного травления позволяет визуализировать структурные элементы зубной эмали для дальнейшего изучения. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) широко используется для изучения влияния кислотного травления на состояние поверхности эмали. D.C. Serbanoiu и соавт. [15] изучали возможность различных способов приготовления эмали влиять на появление артефактов во время АСМ-измерений. F. Watari [16] провёл исследование эволюции микрогеометрии поверхности зубов с применением трёх кислотных агентов. J.P. Simmer с соавт. [17] использовали АСМ для изучения возможностей зубной пасты, содержащей трикальциевый силикат, к реминерализации протравленной кислотой человеческой эмали in vitro. J.P. Loyola-Rodriguez и соавт. [18] сравнили шероховатость поверхности эмали и профиль абсолютной глубины до и после использования четырёх разных концентраций фосфорной кислоты с помощью АСМ. В настоящем исследовании мы применили АСМ для оценки средней шероховатости поверхности (Ra) трёх образцов человеческой эмали из одного зуба. Образцы подвергали травлению с использованием лимонной кислоты различной концентрации в течение разного времени. Для каждой пары «концентрация кислоты–продолжительность травления» значения Ra были определены количественно в трёх направлениях — горизонтальном, вертикальном и диагональном, построены профили поверхности и получены АСМ-изображения поверхностей.

Цель исследования — оценка влияния времени воздействия лимонной кислоты и времени травления на свойства поверхности твёрдых тканей зуба, включая эмаль и дентин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено интервенционное одноцентровое выборочное неконтролируемое исследование эмали, дентина и дентиноэмалевой границы зуба с использованием оптической микроскопии и АСМ.

Критерии соответствия

Критерии включения:

• зубы интактные;
• зубы, удалённые по ортодонтическим показаниям.

Критерии невключения:

• зубы, повреждённые кариесом.

Условия проведения

Исследование выполнено в РЦКП Научно-образовательного центра «Материалы» и на кафедре «Химия» Донского государственного технического университета. Зуб был удалён в стоматологическом отделении клиники Ростовского государственного медицинского университета.

Продолжительность исследования

Эксперименты проводились в течение 6 мес.

Подготовка образцов

Из верхнечелюстного моляра, который был удалён по ортодонтическим причинам у пациента (мужчина, 21 год), получены три образца человеческой эмали.

После удаления зуб выдерживали в 1% растворе гипохлорита натрия (NaClO) в течение 10 мин. Затем его хранили в сбалансированном солевом растворе Хенкса при 4 °С с добавлением гранул тимола для предотвращения роста грибков. Соотношение тимола и сбалансированного солевого раствора Хенкса составляло 1:1000. Зуб был залит эпоксидной смолой для удобства резки. Параметры резки на станке Iso M et 4000 (Buehler, Швейцария) были следующими: скорость вращения диска — 2500 об./мин, скорость подачи образца — 10 мм/мин. Охлаждение пилы осуществляли непрерывной подачей охлаждающей жидкости (Cool 2; Buehler, Швейцария). Два разреза были сделаны таким образом, чтобы второй разрез образовывал срез средней части зуба с повреждением белого пятна (образец перемещали относительно диска с помощью микрометра, встроенного в аппарат). Таким образом, после резки были получены два продольных среза, содержащих здоровую эмаль. На втором этапе каждый из этих двух участков дополнительно разрезали в поперечном направлении, перпендикулярном плоскости первого разреза. Резка проводилась на той же машине и по тем же параметрам, однако на этот раз мы использовали диск из кубического нитрида бора с той же подачей охлаждающей жидкости. В результате выбраны три области в качестве образцов для исследования. Каждый образец снова был залит эпоксидной смолой для обеспечения возможности последующего шлифования и полировки, что было проведено одновременно для всех трёх образцов на станке MetaServ 250 (Buehler, Швейцария). Нагрузка на образец на каждой из стадий шлифования и полировки составляла 10 Н, скорость вращения диска — 100 об./мин. В качестве смазки использовали проточную воду. Подробная информация о параметрах шлифовки приведена в табл. 1.

 

Таблица 1. Параметры шлифовки

Table 1. Grinding parameters

Этап шлифовки	Размер зерна	Абразивная бумага	Время шлифовки, с
1	P800	Siawat 1913 SiC-based (Sia Abrasives, Швейцария)	60
2	P1500	Smirdex SiC-based (Smirdex, Греция)	30
3	P2500	Smirdex SiC-based (Smirdex, Греция)	30

 

Для полировки использовали одинаковую нагрузку и скорость вращения диска. Была приготовлена смазка, состоящая из глицерина и пропиленгликоля, смешанных в пропорции 1:1. Подробная информация о параметрах полировки показана в табл. 2.

 

Таблица 2. Параметры полировки

Table 2. Polishing parameters

Этапы полировки	Размер частиц, мкм	Абразивная жидкость	Время полировки, с	Смазка	Ткань
1	6	MetaDi (Buehler, Швейцария)	120	Глицерин + пропиленгликоль	Trident
2	3	MetaDi (Buehler, Швейцария)	30	Глицерин + пропиленгликоль	Trident
3	1	MetaDi (Buehler, Швейцария)	360	Глицерин + пропиленгликоль	Veltex
4	0,05	MasterPrep (MasterKit, Италия)	480	Дистиллированная вода	Veltex

 

Между каждым этапом шлифовки и полировки проводили ультразвуковую чистку каждого образца в ванне с дистиллированной водой (Sonorex RK 31; Bandelin, Германия) в течение 5 мин и в течение 10 мин после окончательной полировки.

Оптическая микроскопия

После подготовки образца поверхность зубов исследовали с помощью оптического микроскопа Stemi 305 (Carl Zeiss, Германия), оснащённого цветной видеокамерой Axiocam 105 (Carl Zeiss, Германия) в отражённом свете (рис. 1). Эмаль, дентин и дентиноэмалевые границы были чётко видны на изображениях, указывающих на здоровое состояние исследуемых образцов. Образец 1 травили кислотой в концентрации 0,5 мас. % (рН = 2,3), образец 2 — в концентрации 3 мас. % (рН = 1,86), образец 3 — в концентрации 5 мас. % (рН = 1,71). рН измеряли, используя Cobra4 Mobile-Link (PHYWE, Германия). Перед измерением датчик калибровали в растворах с известным pH. На каждом образце травление проводили последовательно в течение пяти периодов: 1, 15, 30, 45, 60 с. Для травления в течение 1 с поверхности образца касались безворсовой тканью, пропитанной кислотой. В течение четырёх других периодов травление осуществляли погружением образца в соответствующий раствор кислоты. После воздействия с кислотой образцы были очищены ультразвуком в дистиллированной воде.

 

Рис. 1. Выбранные области поверхности для сканирования с помощью атомно-силовой микроскопии: a — образец 1; b — образец 2; c — образец 3. © Эко-Вектор, 2025.

Fig. 1. Selected surface areas for atomic force microscopy scanning: a — sample 1; b — sample 2; c — sample 3. © Eco-Vector, 2025.

 

Атомно-силовая микроскопия

Исследование топографии поверхности эмали для каждого образца до и после травления проводили с помощью АСМ на микроскопе NANOEDUCATOR (NT-MDT, Россия), оборудованном вольфрамовым зондом. Устройство работало в бесконтактном режиме. Для всех полученных изображений разрешение составляло 256 × 256 точек, а скорость сканирования — 20 мм/с. Позиционирование выполняли с помощью оптического USB-микроскопа, закреплённого на штативе.

Этическая экспертиза

Работа выполнена в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации (2013), ГОСТ Р 52379-2005 «Надлежащая клиническая практика», приказом Минздрава России от 01.04.2016 N 200н «Об утверждении правил надлежащей клинической практики». Исследование одобрено этическим комитетом Ростовского государственного медицинского университета (протокол № 13/22 от 08.09.2022), от пациента получено письменное добровольное информированное согласие.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование поверхности с помощью оптической микроскопии

Эмаль, дентин и дентиноэмалевая граница были чётко видны на изображениях, которые указывают на здоровое состояние исследуемых образцов (см. рис. 1). Полосы Гунтера–Шрегера также были визуализированы на всех образцах.

Исследование поверхности с помощью атомно-силовой микроскопии

Поверхность каждого из трёх образцов до и после травления в течение 1 с показана на рис. 2, на рис. 3 — после 15 и 30 с травления, на рис. 4 — после 45 и 60 с травления. На рис. 5 показаны профили поверхности для каждого из образцов после каждого этапа травления. Монокристаллы гидроксиапатита можно увидеть на изображении, полученном с помощью атомно-силового микроскопа Nano Compact (Phywe, Германия), на горизонтальном профиле поверхности образца 1 после травления в течение 60 с (рис. 6, 7).

 

Рис. 2. АСМ-изображения поверхностей перед травлением (a — образец 1, b — образец 2, c — образец 3) и после 1 с травления (d — образец 1, e — образец 2, f — образец 3). Изображения не отражают детали микроструктуры. АСМ — атомно-силовая микроскопия. © Эко-Вектор, 2025.

Fig. 2. AFM images of surfaces before etching (a — sample 1, b — sample 2, c — sample 3) and after 1 s of etching (d — sample 1, e — sample 2, f — sample 3). The images do not reflect the details of the microstructure. AFM — atomic force microscopy. © Eco-Vector, 2025.

 

Рис. 3. АСМ-изображения поверхностей после 15-секундного травления образцов (a — образец 1, b — образец 2, c — образец 3) и после 30-секундного травления (d — образец 1, e — образец 2, f — образец 3). Наблюдается качественное изменение микрогеометрии поверхности. АСМ — атомно-силовая микроскопия. © Эко-Вектор, 2025.

Fig. 3. AFM images of surfaces after 15-second etching of samples (a — sample 1, b — sample 2, c — sample 3) and after 30-second etching (d — sample 1, e — sample 2, f — sample 3). Qualitative change in surface microgeometry. AFM — atomic force microscopy. © Eco-Vector, 2025.

 

Рис. 4. АСМ-изображения поверхностей образцов после 45 с травления (a — образец 1, b — образец 2, c — образец 3) и после 60 с травления (d — образец 1, e — образец 2, f — образец 3). АСМ — атомно-силовая микроскопия. © Эко-Вектор, 2025.

Fig. 4. AFM images of sample surfaces after 45 s of etching (a — sample 1, b — sample 2, c — sample 3) and after 60 s of etching (d — sample 1, e — sample 2, f — sample 3). AFM — atomic force microscopy. © Eco-Vector, 2025.

 

Рис. 5. Профили поверхности образцов после каждого этапа травления: 1 — без травления, 2 — после травления в течение 1 с, 3 — в течение 15 с, 4 — в течение 30 с, 5 — в течение 45 с, 6 — в течение 60 с. © Эко-Вектор, 2025.

Fig. 5. Surface profiles of the samples after each etching step: 1 — without etching, 2 — after etching for 1 s, 3 — for 15 s, 4 — for 30 s, 5 — for 45 s, 6 — for 60 s. © Eco-Vector, 2025.

 

Рис. 6. Изображение высокого разрешения образца 1 после 60 с травления. © Эко-Вектор, 2025.

Fig. 6. High-resolution image of sample 1 after 60 s of etching. © Eco-Vector, 2025.

 

Рис. 7. Горизонтальный профиль поверхности образца 1 после 60 с травления (с высоким разрешением). © Эко-Вектор, 2025.

Fig. 7. Horizontal surface profile of sample 1 after 60 s of etching (with high resolution). © Eco-Vector, 2025.

 

Поле сканирования составляло 1,01 × 1,01 мм. Микроскоп был снабжён монокристаллическим Si -зондом с Al -покрытием с резонансной частотой 19 060 кГц и постоянной жёсткостью 48 Н/м. Сканирование поверхности проводилось в динамическом режиме со скоростью сканирования 0,3 мс на линию. Разрешение по оси составляло 1,1 нм, средний квадратичный уровень шума в моде по оси высот — 0,5 нм.

Измерения шероховатости поверхности

Шероховатость поверхности Ra измеряли на каждом этапе травления для каждого образца с использованием программного обеспечения Gwyddion (Чешский метрологический институт, Чешская Республика). Последнее измерение было определено по результатам АСМ-профиля поверхности, полученным на основании данных АСМ (см. рис. 2–5). Из-за возможной нерегулярности визуализированной структуры мы считали измерение шероховатости, основанное на единственном профиле шероховатости в одном направлении, недостаточно корректным. В настоящей работе шероховатость поверхности измерялась в трёх направлениях: горизонтальном, вертикальном и диагональном. В каждом из направлений было построено пять профилей.

Среднее значение этих пяти профилей было принято как абсолютное в этом направлении (Ra_avg). Среднее значение шероховатости в трёх направлениях является абсолютным значением шероховатости данной поверхности (Ra_absol). Результаты измерений для образцов 1–3 представлены в табл. 3–5 соответственно.

 

Таблица 3. Шероховатость поверхности Ra для образца 1

Table 3. Surface roughness Ra for the sample 1

Время, с	Число выбранных точек профиля на базовой длине n	Горизонтальное направление Ra(n)	Raavg	Вертикальное направление Ra(n)	Raavg	Диагональное направление Ra(n)	Raavg	Абсолютная величина шероховатости поверхности Raabsol
0	1	26,9	22,5	26,6	27, 1	18,4	22,8	24,1
	2	26,3		27,1		21,3
	3	20,8		26,6		21,3
	4	21,0		28,7		28,4
	5	17,3		26,5		24,3
1	1	30,4	31,0	33,1	29,6	20,0	24,4	28,3
	2	31,5		28,7		27,0
	3	30,0		25,8		20,7
	4	27,8		28,9		30,4
	5	35,3		31,3		23,8
15	1	27,6	30,5	19,4	20,2	24,8	26,4	25,7
	2	30,1		10,0		32,8
	3	31,6		20,4		21,8
	4	35,6		18,4		32,1
	5	27,6		26,0		20,5
30	1	91,7	99,5	82,1	101,8	82,5	103,0	101,4
	2	153,0		125,3		103,6
	3	107,4		110,9		147,8
	4	67,0		110,1		110,2
	5	78,5		80,4		70,9
45	1	125,6	120,0	153,1	137,7	128,4	115,0	124,2
	2	137,9		123,8		115,9
	3	133,2		86,4		126,4
	4	104,3		153,3		126,6
	5	99,2		161,8		77,6
60	1	194,2	130,8	111,4	126,6	160,6	161,8	139,7
	2	142,0		145,6		150,6
	3	94,5		123,8		130,3
	4	133,1		134,4		187,0
	5	90,1		117,9		180,6

 

Таблица 4. Шероховатость поверхности Ra для образца 2 (выводы)

Table 4. Surface roughness Ra for the sample 2 (conclusions)

Время, с	Горизонтальное направление Raavg	Вертикальное направление Raavg	Диагональное направление Raavg	Raabsol
0	17,1	32,6	28,0	25,9
1	20,4	212	17,4	9,7
15	28,7	40,6	27,6	32,3
30	52,4	70,9	84,3	69,2
45	64,0	69,6	64,2	65,9
60	79,0	83,8	87,7	83,5

 

Таблица 5. Шероховатость поверхности Ra для образца 3 (выводы)

Table 5. Surface roughness Ra for the sample 3 (conclusions)

Время, с	Горизонтальное направление Raavg	Вертикальное направление Raavg	Диагональное направление Raavg	Raabsol
0	25,7	19,0	15,8	20,2
1	26,6	43,6	38,2	36,1
15	126,3	121,7	106,7	118,2
30	89,0	77,5	87,2	84,6
45	171,1	151,9	142,0	155,0
60	255,8	225,0	242,0	241,0

 

Отслеживание изменений, которые произошли на поверхностях образцов во время травления, позволило нам заметить некоторые конкретные важные детали. Поверхность до травления (см. рис. 2, a – c) и после травления в течение 1 с (см. рис. 2, d – f) не продемонстрировала наличия какого-либо ярко выраженного рельефа, была покрыта гладким смазанным слоем, образовавшимся после полировки. Этот слой формировался из остатков структурных компонентов эмали и редких включений абразива в процессе шлифовки/полировки [19]. Исследование поверхности образцов после 15-секундного травления также показало наличие смазанного слоя на образцах 1 и 2 (см. рис. 3, а, b), которые травились более низкими концентрациями лимонной кислоты. Неровно закруглённые структурные элементы — эмалевые призмы (см. рис. 3, c) — отчётливо визуализируются на поверхности образца 3. Последнее наблюдение предполагает, что 15 с травления лимонной кислотой в концентрации 5 мас. % было достаточно для полного удаления смазанного слоя. Особенностью, которая очевидна на последнем изображении, является дифференциальная скорость растворения эмалевых призм. Мониторинг поверхности после 30-секундного травления (см. рис. 3, d – f) на всех образцах показал наличие эмалевых призм в форме круглых и каплеобразных элементов. Кроме того, увеличилось количество визуализируемых элементов поверхности. Более детальная структура отчётливо видна на образцах 2 и 3 (см. рис. 4, e, f). Дополнительная особенность, наблюдаемая на этих и более поздних изображениях, состоит в том, что существует различная ориентированность призм, которые могут быть отнесены к различным исследуемым областям одного и того же зуба. В образцах 2 и 3 призмы выглядят наклонными, в то время как в образце 1 они более нормальны к поверхности. В соответствии с зависимостями шероховатости поверхности Ra от времени травления в разных направлениях (рис. 8) и абсолютной величины шероховатости поверхности Ra_absol при увеличении времени травления (рис. 9) после 30 с травления шероховатость увеличивается довольно устойчивым образом, а после 45 с травления может наблюдаться линейное увеличение значений Ra_absol.

 

Рис. 8. Зависимость шероховатости поверхности Ra от времени травления в разных направлениях (1 — горизонтальное, 2 — вертикальное, 3 — диагональное) для: а — образца 1, b — образца 2, c — образца 3. © Эко-Вектор, 2025.

Fig. 8. Dependence of the surface roughness Ra on the etching time in different directions (1 — horizontal, 2 — vertical, 3 — diagonal) for: а — sample 1, b — sample 2, c — sample 3. © Eco-Vector, 2025.

 

Рис. 9. Зависимость абсолютной величины шероховатости поверхности Ra_absol от времени травления для всех образцов. Номер на графике соответствует номеру образца. © Эко-Вектор, 2025.

Fig. 9. Dependence of the absolute value of the surface roughness of Ra_absol on the etching time for all samples. The number on the graph corresponds to the sample number. © Eco-Vector, 2025.

 

Травление в течение 45 с привело к приобретению более выраженных контуров структурных элементов образцов 2 и 3 (см. рис. 4, b, c). Структура образца 1 по-прежнему оставалась плохо упорядоченной. Непротравленное межпризменное вещество эмали также оставалась на поверхности образцов 1 и 2 (см. рис. 5, а, b). После травления образцов в течение 60 с дальнейших существенных изменений в структуре образцов 1 и 3 не наблюдалось (см. рис. 4, d; см. рис. 4, e). В случае образца 1 концентрация кислоты была все ещё недостаточной для полного удаления эмали из межпризменной области. Структурные элементы образца 2 немного увеличились в размерах и приобрели более обтекаемую форму при протравливании эмали из межпризменного пространства. С увеличением времени травления для всех образцов наблюдалось увеличение чёткости границ призм на профилях поверхности (см. рис. 5). Однако этот процесс более ярко выражен для образца 3. При сравнении результатов травления человеческой эмали с использованием 37% фосфорной кислоты [5] (где авторы получили среднюю шероховатость поверхности 260,9 нм через 30 с) процесс травления в настоящем исследовании протекает медленнее. Нам удалось получить сопоставимое значение шероховатости, используя травление в течение 60 с 5 мас. % лимонной кислотой. В связи с этим можно сделать вывод, что лимонная кислота указанной концентрации больше подходит для контролируемого травления, чем 37% фосфорная кислота. Известно также, что при длительном воздействии фосфорной кислоты эмаль может быть серьёзно повреждена [20].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рассчитана зависимость абсолютных значений шероховатости поверхности от времени травления для всех образцов. Для получения значительной величины шероховатости поверхности и визуализации эмалевой призмы в разумные сроки можно рекомендовать травление лимонной кислотой в концентрации 5 мас. %. После травления в течение 45 с на всех образцах наблюдалось линейное увеличение шероховатости поверхности. Для дальнейшей клинической реализации полученных результатов необходимы дополнительные исследования адгезионных свойств эмали после травления лимонной кислотой.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке гранта Правительства Российской Федерации № 14.Z50.31.0046.

Раскрытие интересов. Авторы декларируют отсутствие отношений, деятельности и интересов (личных, профессиональных или финансовых), связанных с третьими лицами (коммерческими, некоммерческими, частными), интересы которых в свою очередь могут быть затронуты содержанием рукописи, а также других отношений, деятельности или интересов за последние три года, о которых необходимо сообщить.

Участие авторов. С.Ю. Максюков — удаление зубов по ортодонтическим показаниям, обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, написание текста и редактирование статьи; Е.С. Максюкова — обзор литературы, сбор и анализ литературных источников, подготовка и написание текста статьи; О.Н. Рисованная — курация, сбор и анализ литературных источников, подготовка и написание текста статьи. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы и гарантировали, что вопросы, связанные с точностью или добросовестностью любой части работы, будут должным образом рассмотрены и решены.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. The work was supported by a grant from the Government of the Russian Federation grant No. 14.Z50.31.0046.

Disclosure of interests. The authors have no relations hips, activities or interests (personal, professional or financial) with for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the manuscript, as well as other relationships, activities or interests for the last three years that needed to disclose.

Authors’ contribution. S.Yu. Maksyukov — dental extraction for orthodontic indications, literature review, collection and analysis of literary sources, writing and editing of the article; E.S. Maksyukova — literature review, collection and analysis of literary sources, preparation and writing of the text of the article; O.N. Risovannaya — curation, collection and analysis of literary sources, preparation and writing the text of the article. Thereby, all authors provided approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work in ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

About the authors

Stanislav Yu. Maksyukov

Rostov State Medical University

Author for correspondence.
Email: kafstom2.rostgmu@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7823-8906
SPIN-code: 8542-8660

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Rostov-on-Don

Ekaterina S. Maksyukova

Rostov State Medical University

Email: Katerina_maksyukova@mail.ru
ORCID iD: 0009-0004-5495-6726

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Rostov-on-Don

Olga N. Risovannaya

Kuban State Medical University

Email: dentrosa@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0779-1055
SPIN-code: 6283-6910

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Krasnodar

References

Supplementary files