SYNTHETIC LACTOFERRIN IN DENTAL DISEASES PREVENTION AND TREATMENT: CURRENT TRENDS AND PERSPECTIVES

Full Text

В связи с бактериальной этиологией основных стоматологических заболеваний в стоматологии давно и широко используются различные антибактериальные препараты. Появление антибиотико-резистентной микрофлоры и целый ряд побочных эффектов, связанных с длительным применением синтетических антисептиков, делает актуальным поиск новых, более эффективных и безопасных препаратов. В настоящее время для лечения стоматологических заболеваний, связанных с изменениями микрофлоры полости рта, а также снижения резистентности организма к патогенным микроорганизмам все чаще стали применять собственные белки организма в комплексе с синтетическими антибактериальными средствами. Одним из перспективных направлений является использование в лечебных целях белка экзокринных желез лактоферрина, эффективность которого подтверждена целым рядом исследований. Лактоферрин (Lf) - это многофункциональный гликопротеин из семейства трансферринов, способный связывать железо [1]. Он является компонентом секрета экзокринных желез, таких как слюна, слезная жидкость, молоко и молозиво [2], а также присутствует во вторичных гранулах нейтрофилов, из которых он выделяется при инфицировании тканей и воспалительных процессах [3]. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, белок состоит из 691 аминокислотного остатка, которые образуют два гомологичных глобулярных домена, называемые N- и С-долями, концы которых соединены альфа-спиралью. Железо связывается очень прочно, но обратимо. Лактоферрин способен удерживать железо вплоть до pH 3, в то время как другие белки - трансферрины - высвобождают железо при pH 5,5 [3, 4]. Лактоферрин обладает противомикробным, противовирусным, противогрибковым действием, проявляет антиоксидантную и иммуномодулирующую активность, является одним из компонентов врожденной иммунной системы организма [5]. Антибактериальная активность лактоферрина обусловлена его способностью связывать железо и тем самым лишать микрофлору микроэлемента, необходимого для роста и жизнедеятельности [6]. Однако лактоферрин может проявлять и железонезависимую противомикробную активность [3]. Так, положительно заряженные остатки лизина и аргинина в составе лактоферрицина, пептида, находящегося на N-конце молекулы белка, связываются с липидом А липополисахарида (ЛПС), по-другому называемому эндотоксином, или тейхоевыми кислотами (в случае грамположительных микроорганизмов) бактериальных мембран. Это приводит к образованию пор в мембране, повышению проницаемости и последующему ее разрушению [7]. Лактоферрин является важным компонентом слюны и фактором защиты от бактериальных повреждений [3], в том числе против Streptococcus mutans [8] и других пародонтопатогенных бактерий, таких как A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis и P. Intermedia [5]. Кроме того, лактоферрин играет роль в защите полости рта от грибковых инфекций, в частности, вызванных Candida albicans [9]. В 2000 г. H. Wakabayashi и соавт. сообщили, что лактоферрин ингибирует рост in vivo Trichophyton mentagrophytes и Trichophyton rubrum - двух основных этиологических агентов дерматофитоза [10]. Лактоферрин обладает антивирусной активностью против широкого спектра вирусов с РНК и ДНК-геномами. Его действие заключается в способности связываться с гликозаминогликанами клеточной мембраны, препятствуя тем самым связыванию с ними вирусных частиц и дальнейшему проникновению вируса в клетку [11]. В настоящее время доказана активность лактоферрина в отношении цитомегаловируса (CMV) [12], вируса простого герпеса (HSV) [3, 13], вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) [14], вирусов гепатита C (HCV) и гепатита B (HBV) [15]. Лактоферрин также обладает иммуномодулирующими свойствами, играя важную роль в защите организма от инфекций и гиперергической воспалительной реакции [16], которую он способен как усиливать, так и подавлять, обладая про- и противовоспалительными свойствами [17]. Ряд исследований свидетельствуют о том, что лактоферрин активирует макрофаги и индуцирует повышение экспрессии провоспалительных цитокинов: интерлейкина-8 (IL-8), фактора некроза опухоли (TNF) и оксида азота II [18]. В то же время в присутствии лактоферрина изменяется секреция провоспалительного интерферона и снижается продукция IL-5 и IL-17. Таким образом, лактоферрин оказывает противовоспалительное действие [19]. Другое исследование показывает, что присутствие лактоферрина значительно снижает концентрацию провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, IL-1, IL-8 и TNF в десневой жидкости, и, соответственно, уменьшает отек и воспаление [20]. Человеческий лактоферрин является ценным белком для фармацевтической продукции, и поэтому спрос на него постоянно увеличивается. В настоящее время могут быть получены высокоочищенный бычий (bLf), человеческий (hLf) [21], а также козий лактоферрин (gLf) [22]. Было предпринято множество попыток получения рекомбинантного человеческого лактоферрина (rhLF) с использованием прокариотических и эукариотических систем экспрессии [23, 24]. Однако такие трудности, как низкий уровень экспрессии белка, отсутствие точных посттрансляционных модификаций, а также сложные процедуры очистки, сделали современные методики непригодными для крупномасштабного производства [25]. В настоящее время для промышленного синтеза лактоферрина используется биореактор молочной железы крупного рогатого скота. Для этого созданы с помощью маркерных генов трансгенные клонированные коровы с hLf-искусственной бактериальной хромосомой (BAC) [25, 26]. Однако уровень экспрессии hLf составлял 3 г/л, что не сильно превышало результаты предыдущих исследований [27]. Это связано с тем, что присутствие чужеродных маркерных генов мешает экспрессии соседних эндогенных генов [28], в связи с чем была использована безмаркерная технология. Результаты показали, что безмаркерные клонированные коровы с hLf BAC продуцируют rhLf в концентрациях 4,5-13,6 г/л [26]. Другие исследования продемонстрировали эффективность производства rhLf из трансгенного козьего молока путем слияния минигена hLf с регуляторными элементами гена b-казеина [29]. В Российской Федерации разработан инновационный продукт Неолактоферрин, представляющий собой комбинацию рекомбинантного человеческого лактоферрина, полученный биотехнологическими методами, и лактоферрина козы, присутствующий в молоке трансгенных коз. Препарат обладает иммунотропной активностью и является стимулятором врожденного и приобретенного иммунитета [30]. Лактоферрин является многофункциональным гликопротеином и находит применение во многих областях медицины. Так, в гастроэнтерологии Lf может быть использован при лечении воспалительных процессов ЖКТ, особенно связанных с активностью H. pillory [31]. Также многие исследования доказывают эффективность лактоферрина при лечении туберкулеза, вызванного Mycobacterium tuberculosis. Механизм, вероятнее всего, связан с иммуномодулирующим свойством лактоферрина [32, 33]. Перспективным является использование Lf в онкологии. Есть данные, подтверждающие терапевтическую активность лактоферрина in vivo против раковых клеток [34-36]. Подкожное введение лактоферрина продемонстрировало ингибирующее действие как на индуцированный опухолью ангиогенез, так и на рост опухоли у мышей [35]. Кроме того, пероральное введение бычьего лактоферрина крысам, которым ранее вводили азоксиметан для стимулирования канцерогенеза толстой кишки, приводило к снижению частоты аденокарциномы толстой кишки на 83% [36]. В стоматологии исследования H. Wakabayashi доказали ингибирующее действие лактоферрина на рост и образование биопленок двух пародонтопатогенных бактерий, Porphyromonas gingivalis и Prevotella intermedia, которые находятся в виде биопленок в субгингивальной бляшке [37]. Пероральное введение лактоферрина мышам с ослабленным иммунитетом привело к значительному уменьшению числа Candida albicans [9, 38]. Также было выявлено действие лактоферрина против Streptococcus mutans, который является основным возбудителем кариеса [39, 40]. Эти результаты демонстрируют, что лактоферрин обладает широким спектором действия и может быть использован для профилактики и лечения заболеваний полости рта. Возможная активность лактоферрина в отношении кариесогенных микроорганизмов послужила поводом для введения этого компонента в состав средств для гигиены полости рта [41]. В исследовании, проведенном S.L. Piheiro и соавт. [42], сравнивалась эффективность комплекса казеин-фосфопептид-аморфного фосфата кальция и комбинации из лизоцима, лактоферрина и лактопероксидазы против S. mutans. Результаты показали, что второй комплекс более эффективен. Лактоферрин может быть использован не только в качестве местного антибактериального средства, но и для профилактики бактериемии при стоматологических вмешательствах. Было показано, что плохая гигиена полости рта, профессиональное удаление зубных отложений, зондирование пародонтальных карманов и удаление зубов являются наиболее распространенными путями проникновения патогенных микроорганизмов в кровь, что повышает риск возникновения системных заболеваний. Так, S.K. Velausamy и соавт. [39, 40] доказали целесообразность использования лактоферрина при бактериемии. Исследование проводилось на нескольких экспериментальных группах мышей. S. mutans, возбудитель кариеса, был выделен из крови пациентов с бактериемией, инфекционным эндокардитом и сепсисом после удаления зуба. Результаты показали, что у мышей, получавших внутривенно человеческий лактоферрин, наблюдались более низкие уровни КОЕ S.mutans в крови по сравнению с группой мышей, не получавших лечение. Многочисленные исследования демонстрируют защитный потенциал лактоферрина против кандидозной инфекции. Candida albicans является наиболее распространенным грибковым патогеном, формирующим биопленку и ответственным за развитие нескольких типов оральных и системных инфекций, включая кандидоз ротоглотки и системные кандидозные инфекции [43]. Впервые фунгицидное действие лактоферрина в отношении C. albicans было доказано в исследовании C.H. Kirkpatrick и соавт. [44]. Впоследствии этот эффект был подтвержден целым рядом лабораторных и клинических исследований [9, 38, 45]. N. Takakura и соавт. [38] оценили эффективность бычьего лактоферрина в отношении C. albicans. Бычий лактоферрин в концентрации 0,3% добавляли в питьевую воду и давали экспериментальной группе мышей с ослабленным иммунитетом за один день до заражения и на протяжении всего исследования. Для определения степени тяжести инфекции использовали КОЕ, оценку поражений в полости рта и микроскопические наблюдения. Результаты показали, что введенный бычий лактоферрин может быть использован для предотвращения инфекции C. albicans. Предполагаемый механизм фунгицидного действия связан с нарушением целостности клеточной стенки: возникновением поверхностных пузырей, выпуклостей, что, в конечном итоге, приводит к гибели клетки [43]. Аналогичное исследование было проведено K. Velliyagounder и соавт. [9], но с использованием человеческого лактоферрина. Результат исследования также продемонстрировал высокую эффективность исследуемого препарата. Оба этих лактоферрина имеют сходство нуклеотидов более, чем на 77%, и оба белка эффективно снижают кандидоз полости рта [44]. Результаты клинического исследования, проведенного в 2002 г. M.E. Kuipers и соавт. подтвердили эффективность таблеток для рассасывания с лактоферрином при лечении кандидоза ротоглотки [46]. J.R. Masci и соавт. [47] показали, что включение лактоферрина и лизоцима в состав ополаскивателя для полости рта эффективно при лечении кандидоза, устойчивого к антигрибковым препаратам, у пациентов с ВИЧ. В настоящее время используются комбинации лактоферрина и противогрибковых препаратов для лечения заболеваний, вызванных штаммами с лекарственной устойчивостью [9]. Исследования, проведенные V. Kirstila [48] и J.A. Gil-Montoya и соавт. [49], доказали клиническую эффективность применения средств для гигиены полости рта, содержащих лактоферрин, у пациентов с ксеростомией. В исследованиях V. Kirstila и соавт. [48] и J.A. Gil-Montoya и соавт. [49] 20 пациентов использовали зубную пасту, содержащую лактопероксидазную систему (биотен), в сочетании с ополаскивателем (биотен), содержащим лизоцим и лактоферрин, в течение 4 нед. Образцы слюны собирали в начале эксперимента и после 4 нед использования продуктов. Результаты показали, что ежедневное использование зубной пасты и ополаскивателя для полости рта в течение исследуемого срока ослабило симптомы сухости полости рта у 16 пациентов из 20. Также большое внимание уделяется возможности использования лактоферрина в комплексном лечении заболеваний пародонта. Целый ряд исследований посвящен эффективности лактоферрина в отношении Porphyromonas gingivalis и Prevotella intermedia, которые являются этиологическими агентами хронического пародонтита у взрослых [50] и присутствуют в субгингивальной биопленке [51, 52]. K.R. Alugupali и соавт. [53] показали, что человеческий и бычий лактоферрины ингибируют адгезию P. intermedia к эпителиальным клеткам. Однако в исследовании O. Aguilera и соавт. [54] установлено, что человеческий лактоферрин проявляет ингибирующую активность в отношении P. gingivalis, но не P. intermedia. Другое клиническое исследование, проведенное I. Kondo и соавт. [55], показало, что пероральный прием бычьего лактоферрина пациентами с хроническим пародонтитом, уменьшало количество P. gingivalis и P. intermedia в субгингивальной бляшке. Аналогичное исследование H. Wakabayashi и соавт. [5] позволило оценить in vitro эффективность человеческого лактоферрина, железонасыщенного и железоненасыщенного бычьего лактоферрина и нативного бычьего лактоферрина против образования биопленки P. gingivalis и P. intermedia. Результаты показали, что лактоферрин-связанные агенты ингибировали образование биопленки P. gingivalis в зависимости от дозы; таким образом, эти агенты были эффективны даже при низкой концентрации 0,008 мг/мл. Аналогично человеческий лактоферрин при 0,13 мг/мл, железонасыщенный и железоненасыщенный бычий лактоферрин, а также нативный бычий лактоферрин при 0,031 мг/мл ингибировали образование биопленки P. intermedia. Также была исследована эффективность нативного бычьего лактоферрина в комбинации с четырьмя антибиотиками, такими как ципрофлоксацин, кларитромицин и миноциклин против сформированной биопленки P. gingivalis [8] . Предположительный механизм антимикробного действия связан со способностью человеческого и бычьего лактоферрина связываться с клетками P. gingivalis и P. intermedia, как было показано S. Kalfas и соавт. [56]. Бычий лактоферрин также препятствует связыванию P. intermedia с белками, такими как фибронектин, коллаген I и IV типов и ламинин, а также с фибробластами и эпителиальными клетками [53]. Следовательно, лактоферрин может взаимодействовать с клеточной поверхностью P. Gingivalis и P. intermedia и нарушать их связывание с эпителием ротовой полости. S.K. Velusamy и соавт. [57] сообщают об эффективности человеческого лактоферрина против пародонтопатогена A. actinomycetemcomitans у мышей при внутривенном введении. Исследование также показало, что человеческий лактоферрин значительно снижал концентрации сывороточных провоспалительных цитокинов, таких как гамма-интерферон (IFN-γ), альфа-фактор некроза опухоли (TNF-α), интерлейкин-1β (IL-1β), IL-6, IL-10. Эксперимент проводился на группах мышей, которым вводили лактоферрин орально или внутривенно, и инъецировали A. actinomycetemcomitans в разные промежутки времени, тем самым показывая профилактическое и терапевтическое действие лактоферрина. Результаты анализов выявили, что внутривенное введение человеческого лактоферрина значительно эффективнее перорального введения. Также было отмечено, что лактоферрин может функционировать как противовоспалительный фактор, поскольку он регулирует выработку воспалительных цитокинов [58]. На основании исследований in vitro и in vivo сделано предположение, что эта противовоспалительная активность может быть связана с ингибированием некоторых цитокинов, включая TNF-α и IL-1β, которые являются ключевыми медиаторами воспалительного ответа [59]. M. Nakano и соавт. [60] изучали влияние лактоферрина и лактопероксидазы на микробиоту полости рта у пожилых людей. Результаты через 8 нед свидетельствуют о том, что таблетки, содержащие лактоферрин и лактопероксидазу, способствуют переходу от очень разнообразного грамотрицательного доминирующего сообщества к грамположительному в микробиоте наддесневого налета и поверхности языка. Это может способствовать улучшению здоровья полости рта. Вывод Таким образом, клинические исследования подтверждают эффективность лактоферрина и отсутствие побочных эффектов при его использовании в стоматологии. Кроме того, активно разрабатываются новые методики синтеза и способы включения лактоферрина в лекарственные препараты, а также в средства гигиены полости рта. Уникальные свойства лактоферрина делают перспективным его использование в лечении заболеваний полости рта в качестве самостоятельного препарата, а также в комплексе с синтетическими антибактериальными средствами.

About the authors

A. V Shirokova

Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

119991, Moscow

A. Yu Turkina

Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

119991, Moscow

Yuriy Olegovich Paramonov

Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Email: paramonovy@mail.ru
assistant of department clinical dentistry of the I.M. Sechenov First Moscow State Medical University 119991, Moscow

References

Supplementary files