Биохимия

Рак желудка (РЖ) является одной из самых распространённых злокачественных опухолей в мире и занимает пятое место в структуре онкологической смертности. МикроРНК вовлечены в патогенез и прогрессию РЖ как эпигенетические факторы и рассматриваются в качестве вероятных маркеров для неинвазивной диагностики. Нами были выбраны микроРНК, задействованные в регуляции эпигенетических механизмов при РЖ (miR-1301-3p, miR-106a-5p, miR-129-5p, miR-3613-3p, miR-647), и проведён анализ уровня их представленности в плазме крови пациентов. С целью оценки их диагностического и прогностического потенциала мы осуществили поиск корреляций дифференциальной экспрессии с клинико-патологическими характеристиками опухоли при РЖ. В исследование включены 65 образцов плазмы пациентов с РЖ и 48 образцов плазмы, полученной от лиц без опухолевого поражения, которые использовались в качестве контрольной группы. Анализ уровня представленности транскриптов в плазме проведён с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). При сравнении уровней представленности выбранных микроРНК в плазме пациентов с РЖ и контрольной группы показаны достоверные различия для miR-1301-3p (p = 0,040), miR-106a-5p (p = 0,029), miR-129-5p (p < 0,0001), miR-647 (p < 0,0001). Экспрессия miR-129-5p достоверно ассоциирована с распространённостью первичной опухоли (p = 0,002), с развитием метастазов в регионарные лимфатические узлы (p = 0,003) и отдалённых метастазов (p = 0,003), а также поздней клинической стадией (p = 0,003). Выявлена достоверная корреляция экспрессии miR-3613-3p с клинической стадией РЖ (p = 0,049). При проведении ROC-анализа показано, что объединение miR-106a-5p, miR-129-5p, miR-1301-3p и miR-647 улучшает диагностические и прогностические свойства потенциальной панели маркеров.

Исследование биологии теломер продолжает оставаться актуальной проблемой. В последние годы на основе анализа нескольких тысяч клинических образцов здоровых лиц показано, что длина теломер (ДТ) лейкоцитов периферической крови коррелирует с ДТ клеток внутренних органов человека и отражает их состояние, снижается при действии повреждающих факторов и может служить показателем состояния здоровья. Снижение ДТ приводит к остановке пролиферации и рассматривается как показатель репликативного старения пролиферирующих клеток, а снижение ДТ лейкоцитов периферической крови – как показатель старения организма. Новые данные фундаментальных исследований позволили сформулировать представления о роли CST–полимеразы альфа/праймазы в синтезе комплементарной С-цепи ДНК после завершения синтеза 3′-G-оверхэнга теломеразой при репликации теломер. Открытие теломерной РНК TERRA и её роли в регуляции активности теломеразы (АТ) и альтернативного удлинения теломер, а также возможности трансляции TERRA стало свидетельством сложной регуляции поддержания ДТ на эпигенетическом уровне. Анализ совокупности опубликованных данных позволяет заключить, что теломеры являются динамическими структурами, и что ДТ претерпевает существенные изменения под воздействием повреждающих факторов и определяется не просто хронологическим возрастом, а суммарным эффектом воздействия всех экзогенных и эндогенных повреждающих факторов в течение жизни. Наследуемое снижение ДТ, обусловленное появлением мутаций в генах белков, определяющих строение теломер и участвующих в репликации теломер, в первую очередь белков шелтеринового комплекса, комплекса CST и теломеразы, обнаружено при ряде генетически обусловленных заболеваний – теломеропатий. Определение ДТ и АТ имеет большое значение для диагностики теломеропатий и может быть полезно при диагностике рака, а определение ДТ – для мониторинга состояния здоровья, в том числе при действии ионизирующего излучения и факторов космического полёта, и для прогноза индивидуальной чувствительности к действию повреждающих факторов разной природы. Разработанные в настоящее время генетические технологии анализа ДТ и АТ доступны для использования в клинических и эпидемиологических исследованиях, активно применяются при диагностике теломеропатий и мониторинге состояния космонавтов и продолжают совершенствоваться.

Туберкулез занимает лидирующее место по смертности среди бактериальных инфекций. Разработка новых противотуберкулезных вакцин может позволить снизить количество новых случаев заболеваний и смертность от него. Одно из наиболее перспективных направлений вакцинации представляют мРНК-вакцины, уже доказавшие свою высокую эффективность против COVID-19 и других вирусных инфекций. В нашем исследовании мы разработали 4 новые мультиэпитопные мРНК-вакцины против туберкулеза с использованием современных методов иммуноинформатики, отличающиеся друг от друга последовательностями кодируемых адъювантов и кодонным составом, и проверили их иммуногенность и протективность в экспериментах на мышах. Большинство из разработанных мРНК-вакцин привели к формированию как клеточного, так и гуморального иммунитета. При этом адаптивный ответ был сильнее в случае использования вакцин с адъювантом RpfE. Однако лучший протективный ответ продемонстрировала вакцина mRNA-mEp21-FL-IDT с адъювантом FL, обеспечившая снижение бактериальной нагрузки в легких после заражения мышей M. tuberculosis и увеличившая выживаемость животных. В совокупности полученные нами результаты показывают, что разработанная с помощью методов иммуноинформатики мРНК-вакцина mRNA-mEp21-FL-IDT обеспечивает эффективную защиту, сопоставимую с защитой, наблюдаемой после вакцинации БЦЖ.

Количество летальных исходов от осложнений, вызванных тяжелой формой гриппа и COVID-19, во всем мире составляет около 1 миллиона случаев ежегодно. Поиск эффективных стратегий противовирусной терапии после заражения вирусом является приоритетной задачей. Одна из таких потенциальных противовирусных стратегий – это использование системы CRISPR/Cas13, которая обеспечивает специфическую деградацию вирусной РНК и значительно снижает титр вируса. Несмотря на недавнее открытие CRISPR/Cas13, эта система уже показала свою высокую эффективность в подавлении вирусных транскриптов в работах на культурах клеток. Недавний прогресс в технологии мРНК и совершенствование систем невирусной доставки сделали возможным эффективное применение CRISPR/Cas13 и на животных моделях. В этом обзоре мы проанализировали экспериментальные исследования in vitro и in vivo по применению систем CRISPR/Cas13 в качестве противовирусного агента на клетках и животных, а также обсудили основные направления совершенствования системы CRISPR/Cas13. Эти данные позволяют понять перспективы и ограничения дальнейшего использования CRISPR/Cas13 в терапии вирусных заболеваний.

Данное исследование посвящено разработке термостабильных и термоактивируемых мини-интеинов на основе полноразмерного интеина DnaE1 из Thermus thermophilus HB27. В результате проведённого рационального дизайна на основе полноразмерного интеина путём внесения делеций были сконструированы мини-интеины TthDnaE1 Δ272, Δ280 и Δ287. Высокую эффективность сплайсинга наблюдали для TthDnaE1 Δ272 и Δ280 при температурах выше 50 °С. Наиболее активный мини-интеин с делецией Δ280 выбрали в качестве основы для создания самоотщепляющегося носителя аффинных меток путём точечного мутагенеза. Осуществлены мутации C1A, D405G и C1A/D405G, направленные на устранение возможности отщепления N-концевого экстеина и лигирования экстеинов. В результате максимальную эффективность отщепления C-экстеина наблюдали при температуре 60 °С у мини-интеина Δ280 с двойной мутацией C1A/D405G. Таким образом, нами были сконструированы термостабильные и термоактивируемые мини-интеины, способные к эффективному белковому сплайсингу или отщеплению C-концевого экстеина. Созданный мини-интеин TthDnaE1 Δ280 С1A/D405G может служить основой для разработки новой экспрессионной системы, предназначенной для интеин-опосредованного получения рекомбинантных белков и пептидов медицинского назначения.